本发明专利技术涉及带有穿膜肽的TCS融合蛋白、质粒及制备方法与应用。融合蛋白包括TCS与穿膜肽，所述的穿膜肽为人源性穿膜肽，选自ARF、HBD或TAT，所述的融合蛋白中还含有连接肽，所述的连接肽为2个氨基酸到20个氨基酸长度的连接肽，优选为柔性的连接肽。同时，可将带有穿膜肽的TCS融合蛋白用在制备抗肿瘤药物中。与现有技术相比，本发明专利技术在重组天花粉蛋白中引入穿膜肽，通过引入穿膜肽，有效促进了TCS跨过细胞膜进入细胞的能力，并增强了TCS的抗肿瘤活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天花粉蛋白的应用，尤其是涉及一种带有穿膜肽的TCS融合蛋白、质 粒及制备方法与应用，属于基因工程
技术介绍
天花粉蛋白（TCS)是传统中药天花粉的主要活性成分，属I型核糖体失活蛋白，天 花粉蛋白本来是用于孕妇堕胎及流产的。此外，天花粉蛋白还具抗肿瘤活性，目前，关于天 花粉蛋白（TCS)在抗绒膜癌、抗宫颈癌、抗白血病淋巴瘤、以及对其他肿瘤细胞的作用已经 进行了深入研究。已有研究报道TCS能识别细胞膜表面LRP1受体但是穿膜效率低，而TCS 本身过敏性强，在药用过程中加入大剂量的TCS显然是不可行的，甚至是很危险的。 -些包括TCS在内的抗肿瘤药物具有杀伤癌细胞的能力，然而一些药物的穿膜能 力弱，因此导致用药剂量增大，进而引发许多不良反应。为了克服这一瓶颈，研究人员使用 了多种方式将药物导入细胞，如电穿孔法、显微注射、脂质体等，但是这些方法在应用过程 中，或者会损伤细胞膜，或者受到人体内环境的受到诸多限制，因此很难在临床应用，穿膜 肽作为新近最热点的药物运输载体，能够解决药物蛋白的穿膜难题。它的引入能够调高药 物穿膜效率，进而降低药物使用剂量，减轻患者用药痛苦，在临床治疗中具有重要意义。穿 膜肽大多相对较短，长度一般小于30个氨基酸，是两性带阳离子的短肽，并且能够携载大 分子进入细胞，同时细胞毒性很低。穿膜肽在蛋白运输以及寡聚核苷酸的运输上起到作用。 基因工程技术重组表达具有活性的蛋白分子时需要考虑到将融合蛋白的两个功 能域直接相连，可能会造成他们在功能上的互相影响，同时也会带来一些其他问题，如表达 量低以及以包涵体形式表达等。所以在构建重组蛋白时，会在两个功能域之间加入连接肽， 以改善融合蛋白在功能以及制备方面的问题。在构建融合蛋白时，连接肽是必须考虑的因 素之一，不同形式的连接肽有着不同特点和作用。选择连接肽时需要考虑各蛋白功能域的 特点及相互间的作用。因此连接肽的结构与形式关系到融合蛋白的生物活性，选择正确的 连接肽对保证融合蛋白的生物活性至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种带有穿膜肽的 TCS融合蛋白、质粒及制备方法与应用。 本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现： 本专利技术的第一方面提供一种带有穿膜肽的TCS融合蛋白，其包括TCS与穿膜肽，所 述的穿膜肽为人源性穿膜肽，选自ARF、HBD或TAT，尤其是HBD。 所述的ARF由人肿瘤抑制因子pl4ARF的N端1-22位氨基酸组成，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所不；为 Val Arg Val Arg Pro Pro Gly Cys Ala Arg Arg lie Arg Leu Thr Val Leu Phe Arg Arg Val Met ； 所述的HBD为人超氧化物歧化酶C端部分氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 20Τ7]ν ；^Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gin Ala Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala ； 所述的TAT为HIV反式激活因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；为Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg〇 所述的融合蛋白中还含有连接肽，所述的连接肽为2个氨基酸到20个氨基酸长度 的连接肽，优选为柔性的连接肽； 进一步优选为氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示的柔性的17氨基酸连接肽。具体 序列为 Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gin Ala Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser〇 还可以选择柔性的7氨基酸连接肽（linker 7F，氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示， 为Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser)和刚性的7氨基酸连接肽（linker 7S，氨基酸序列如 SEQ ID Ν0· 6 所示，为 Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ser)。 本专利技术第二方面提供一种含有带有穿膜肽的TCS融合蛋白的重组质粒。 本专利技术第三方面提供一种带有穿膜肽的TCS融合蛋白的制备方法。 带有穿膜肽HBD的TCS融合蛋白制备方法，包括以下步骤： (1)构建TCS-连接肽-HBD重组质粒，具体包括以下步骤： (11)用CTAB法从叶片中抽提天花粉基因组DNA，以序列如SEQ ID N0. 7所示的上 游引物和序列如SEQ ID N0.8所示的下游引物为反应引物，以抽提的基因组DNA为模板，其 中TCS基因的核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示，PCR反应，获得TCS蛋白的编码基因，即目 的基因； (12)用基因纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将目的基因和HBD表达质粒用Nde I进行双酶切，T4连接酶连接后，获得TCS-连接肽-HBD重组质粒，将该重组质粒 转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆送样测序，其中HBD表达质粒中含有连接肽，是基因 合成的。 所述的PCR反应的条件是：94°C预变性5min，95°C变性lmin，55°C退火30s，72°C 延伸lmin，循环30次，最后72°C延伸5min。 (2)利用大肠杆菌BL21异源表达TCS-连接肽-HBD融合蛋白，具体包括以下步骤： 将测序正确的含有TCS-连接肽-HBD重组质粒的大肠杆菌BL21在含有100 μ g/mL卡那霉 素的LB培养基中37°C培养，当0D6。。达到0. 8时，加入终浓度为ImM的IPTG，15°C诱导表达 12~14h，异源表达TCS-连接肽-HBD融合蛋白。 (3)分离纯化TCS-连接肽-HBD融合蛋白，具体包括以下步骤： (31)在上样过程中，Ni-NTA纯化系统中的镍离子识别并亲和带6xHis Tag标签的 蛋白质，随后加入洗脱缓冲液，使目标蛋白从柱上脱落； (32)收集菌体，按公式V缓冲'液（μ 1) = 0D6。。X 50 X V菌液，所入缓冲液悬浮菌体， (33)悬浮的菌体用200W的超声功率进行菌体破碎，5s超声和5s暂停为一个循 环，共99个循环，后经低温离心，分离上清和包涵体，取上清组分上样； (34)用5倍柱体积缓冲液平衡Ni-NTA层析柱，流速保持约4~5s每滴，使其pH 达到稳定； (35)把样品缓慢多次加入层析柱，流速保持4~5s每滴，使样品与介质充分结 合； (36)待上样结束后，用3~5倍缓冲液洗涤柱体，以洗去非特异性结合的杂蛋白； (37)用20mM咪唑溶液洗涤柱体，并以200mM咪唑溶液洗脱目的蛋白进行收集，其 中缓冲液体系为20mM Tris-HCl pH 8. 5,最终得到带有连接肽的高度纯化的目标蛋白，即 TCS-连接肽-HBD融合蛋白。 带有穿膜肽TAT的TCS融合蛋白的制备方法， 将TCS表达质粒pET28b-TCS-HBD用BamH I/Xho I进行双酶切，与退火产物以T4 连接酶连接后，获得TCS-连接肽-TAT重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，挑 选阳性克隆送样测序。带有穿膜肽TAT的TCS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种带有穿膜肽的TCS融合蛋白，其特征在于，包括TCS与穿膜肽，所述的穿膜肽为人源性穿膜肽，选自ARF、HBD或TAT。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵健，陆叶舟，曹雪玮，李鹏飞，林冰，李堰忠，罗璠，郭超，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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