双生物素化标签制造技术

提供了多生物素化的反应物，其可用于二价复合物，供于多种应用如共定位、标记、固定化和纯化。也提供可构建、纯化和使用双生物素化的反应物的方法。在某些实施方式中，2个双生物素化的反应物结合至单个链霉亲和素四聚体以提供具有相对于双生物素化的反应物的化学计量为1:1的复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】双生物素化标签 相关申请的交叉参考 本申请要求2013年6月14日提交的美国临时申请号61/835,311的权益，该申请 通过引用全文纳入本文用于所有目的。 关于联邦资助研究的声明 未应用。
技术介绍
分子生物学中的一个共同任务是鉴定并定量复杂混合物中蛋白质的存在。例如， 为了鉴定感兴趣蛋白质的表达水平，可进行Western印迹，其中在凝胶上运行蛋白质提取 物并且用针对感兴趣蛋白质的限定表位的抗体染色。限定表位可以是在天然蛋白质中发现 的特定序列或结构，或者可以是在克隆期间导入的标签，例如"FLAG标签"，可购得针对其的 抗体。使用对与蛋白质结合的一抗有特异性的过氧化物酶偶联的二抗来生成可检测的信 号。这种方法是繁琐的，需要用于从细胞提取物中纯化蛋白质的更合理化的方法。 将光学标记物连接到蛋白质可以是检测和定量的替代策略，然而，这一般需要对 蛋白质内残基的化学修饰。通过赖氨酸或半胱氨酸残基连接染料通常改变了活性或降低溶 解性，使得带标记的蛋白质难以或不可能被纯化。荧光蛋白质标签具有多种光谱性质，例如 Shaner等，（2005)NatureMethods2(12) :905-909所述，其通过引用全文纳入本文用于所 有目的，但是这些标签对于单分子实验而言是次优的。 化学合成DNA的能力使得可能构建在自然中未发现的肽和蛋白质并且可用于多 种方法，这些方法在其它情况中难以或不可能实施。例如，大量描述受体蛋白质重组表达 的公开的专利文献。参见，例如，PCT专利公开号91/18982以及美国专利号5, 081，228和 4, 968, 607,其描述了编码IL-1受体的重组DNA分子；美国专利号4, 816, 565、4, 578, 335和 4,845, 198,其描述了与IL-2受体相关的重组DNA和蛋白质；PCT专利公开号91/08214,其 描述了与核酸相关的EGF受体；PCT专利公开号91/16431和美国专利号4, 897, 264,其描述 了干扰素γ受体与相关的蛋白质和核酸；欧洲专利局（ΕΡ0)公开号377, 489,其描述了C5a 受体蛋白质；PCT专利公开号90/08822,其描述了ΕΡ0受体和相关的核酸；PCT专利公开号 92/01715,其描述了MHC受体；和1992年9月18日提交的美国专利申请系列号947,339， 其描述了如何从细胞表面上切下含HPAP的受体以及保留的锚定序列如何可用作用于固定 受体的抗体的识别序列。各自通过引用纳入本文用于所有目的的这些文献中的几种描述了 如何分离特定受体蛋白质（或编码该蛋白质的基因）以及可以自然或天然受体不可使用的 方式使用的受体变体。 伴随着相对于受体克隆和表达的进步，已有与筛选针对可能以所需的方式与受体 相互作用的化合物的受体的方法相关的技术进步。在多种随机和半随机"肽多样性"生成 系统中，一种这类进步与大量化合物或潜在配体的生成相关。这些系统包括"质粒上肽"系 统，其描述于美国专利号5, 338, 665,其是美国专利号5, 270, 170中的部分继续申请；"噬菌 体上肽"系统，其描述于1991年6月20日提交的美国专利申请系列号718, 577,其是1990 年6月20日提交的系列号541，108的部分继续申请；Cwirla等，1990年8月，Proc.Natl. Acad. Sci. USA87:6378-6382;Barrett等，1992,Analyt. Biochem.204:357-364;以及PCT 专利公开号91/18980和91/19818 ;基于噬菌体的抗体展示系统，其描述于1990年5月11 日提交的美国专利申请系列号517, 659,和PCT专利公开号91/17271;用于生成和筛选核酸 配体的基于珠的系统，其描述于PCT公开号91/19813、92/05258和92/14843;基于珠的系 统，其描述于1992年9月16日提交的美国专利申请系列号946, 239,其是1991年9月18 日提交的系列号762, 522的部分继续申请；和"非常大规模的固定的聚合物合成"系统，其 描述于美国专利号5, 143, 854;PCT专利公开号90/15070和92/10092,1990年12月6日提 交的美国专利申请系列号624, 120，；Fodor等，1991年2月15日，Science251:767-773; Dower和Fodor,1991，Ann.R印.MecL Chem.26:271-180;和 1991 年 12 月 6 日提交的美国专 利申请系列号805, 727。上述参考文献各自通过引用纳入本文用于所有目的。 其它发展涉及在这类筛选方法中如何使用受体。与用于在空间上限定的阵列中 固定一个或多个受体的试剂和方法的发展相关的一个重要进步描述于PCT专利公开号 91/07087,其描述了受体与亲和素结合并且随后固定在含生物素基团的表面上。一旦亲和 素化受体与表面上的生物素基团结合，该表面可用于筛选针对该受体的化合物。 生物素是与参与活化的羧基转移的几种酶共价连接的辅因子。对通常没有生物素 化的分子进行生物素标记可用于标记、检测、纯化和/或固定这类分子。这些方法也依赖 于蛋白质亲和素和/或链霉亲和素，其与生物素非常紧密且特异性地结合。一般而言，通 过体外生物素化方法制备这类方法中使用的生物素化的分子。替代地，由于使用生物素作 为亲和标签的能力，对通过重组DNA技术合成的蛋白质体外生物素化的方法消除了在纯化 后化学上生物素化这些蛋白质的需要并且极大地简化了纯化方法（参见Green，1975,Adv. ProteinRes. 29:85-133,其通过引用纳入本文）。 也可使用生物素-链霉亲和素相互作用来将不同的分子连接在一起以形成有用 的复合物。例如，由于链霉亲和素具有4个生物素结合位点，4个生物素标记的分子可连 接到单个链霉亲和素分子上。包括通过链霉亲和素分子连接生物素标记的分子的方法的 某些具体实施例在本领域中详细描述，例如，在2013年2月14日提交的美国专利申请号 13/767,619 ;美国专利号8, 389, 676 ;和美国专利号8, 252, 910中，其通过引用全文纳入本 文用于所有目的。然而，生成2个分子的强1:1复合物对于一些应用是有用的，并且由于其 四价性质，这可能对于链霉亲和素而言是困难的。可能生成许多不同的化学计量，例如，1:3 和3:1。之前已经描述了产生具有减少数量的活性位点的链霉亲和素四聚体的方法，例如在 Howarth等，（2006)NatureMethods3(4) :267-73中，其通过引用全文纳入本文用于所有目 的。然而，Howarth的方法包括混合2种重组链霉亲和素并且是繁琐的。
技术实现思路
本专利技术提供了可用于生物素化分子并将生物素化的分子通过生物素结合试剂如 链霉亲和素连接在一起的化合物、试剂、方法和试剂盒。本专利技术提供了包含双生物素化的试 剂以及与生物素结合试剂，例如链霉亲和素结合的这类双生物素化的试剂的组合物。在优 选的实施方式中，双生物素标签与链霉亲和素或其它生物素结合试剂结合，使得该双生物 素标签结合链霉亲和素四聚体的二聚体上的2个生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含第一反应物、第二反应物和链霉亲和素四聚体的组合物，所述第一反应物共价偶联到第一双生物素标签，所述第二反应物共价偶联到第二双生物素标签，并且所述链霉亲和素四聚体结合至2个双生物素标签。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·米勒，S·卡姆特卡，K·比约森，J·哈尼斯，
申请(专利权)人：加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US