耐热性纤维二糖水解酶制造技术

本发明专利技术的耐热性纤维二糖水解酶至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性，是由序列号1、3、5或7所示氨基酸序列构成的多肽，是由序列号1、3、5或7所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的多肽，或者是由与序列号1、3、5或7所示氨基酸序列具有80％以上且不足100％的序列一致性的氨基酸序列所构成的多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】耐热性纤维二糖水解酶
本专利技术涉及纤维二糖水解酶的耐热性。纤维二糖水解酶是水解纤维素、半纤维素等木质纤维素而生成单糖的过程中涉及的糖苷水解酶的一种。更具体而言，本专利技术涉及一种新耐热性纤维二糖水解酶、编码该耐热性纤维二糖水解酶的多核苷酸、用于表达该耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、整合了该表达载体的转化体、以及使用该耐热性纤维二糖水解酶的纤维素分解产物的制造方法。本申请要求2013年3月27日提交的国际申请号为PCT/JP2013/059028号的国际申请的优先权，并在本文中引用其内容。
技术介绍
除地球温暖化和大气污染等环境上的问题之外，出于对原油价格的大幅上涨、以及不久的将来的原油枯竭的预想(石油峰值论)等运输用能源供应的担忧，近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质或木质纤维素是地球上最丰富的可再生能源，作为石油替代资源而备受期待。生物质干重的主要成分为纤维素、半纤维素等多糖类以及木质素。例如，多糖类被统称为纤维素酶的糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解或糖化。对于木质纤维素的全分解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶(纤维素酶或内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC3.2.1.4)、外切型纤维二糖水解酶(1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)这三种酶。对于木质纤维素的水解，据认为另外还需要适当添加作为半纤维素酶的木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶，EC3.2.1.8)、以及包括其他植物细胞壁分解酶的多个酶。在以木质纤维素为资源制造生物乙醇时，以乙醇的高能效转化为目的，尝试了基于高固体负荷(30～60％的固体负荷)的糖化处理。这种基于高固体负荷的糖化虽然生物质糖化液的粘性高、难以进行酶促反应，但是通过在高温下进行，使生物质糖化液的粘性降低，结果有望实现缩短糖化反应时间和降低酶量。此外，根据范特霍夫-阿伦尼乌斯规则(van’tHoff-Arrhenius)，通常化学反应的温度上升10℃，反应速度增加2-3倍。因此，以与传统相比更高的温度使用耐热性纤维素酶进行木质纤维素糖化处理时，遵从该经验规则应该可获得快的酶反应速度。由上述理由可以认为，通过使用耐热性酶在高温下进行木质纤维素糖化处理，可以大幅降低酶量和糖化时间，减少酶的成本。作为真核生物的嗜热丝状真菌与作为原核生物的嗜热菌和超嗜热古细菌相比，其生存极限温度低，为55℃左右。因此，嗜热丝状真菌表达分泌的糖苷水解酶的耐热性通常不是很高。在目前的报导中来源于耐热性最高的丝状真菌的CBH(纤维二糖水解酶)，嗜热丝状真菌嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)的纤维二糖水解酶CBHⅠ、CBHⅡ表现出的最适温度分别为75℃和70℃(例如参照非专利文献1)，嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的纤维二糖水解酶CBHⅠ的最适温度为65℃(例如参照非专利文献2。)。虽然有通过取代纤维二糖水解酶中的一个或多个氨基酸来进一步提高耐热性的方法(例如参照专利文献1或2。)，但是这样获得的突变型纤维二糖水解酶的耐热性仍然不足。另一方面，对来自于温泉、热液喷口、油田和矿山等极限环境的、生长于55℃以上的嗜热菌和生长于80℃以上的超嗜热菌进行分离培养。来源于这些嗜热菌和超嗜热古细菌的耐热性糖苷水解酶，其大部分为具有内切葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性、木糖苷酶活性或葡糖苷酶活性的酶。在木质纤维素水解过程中起到最重要作用的纤维二糖水解酶为仅分离自属于梭菌属(Clostridium)、嗜热菌属(Thermobifida)、热袍菌属(Thermotoga)的三种嗜热菌中的几种。例如，嗜热厌氧菌热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)在菌体外表示具有高木质纤维素水解活性的复合酶纤维体。纤维体的主要酶为纤维二糖水解酶，分离出属于GH5家族的CelO、属于GH9家族的Cbh和CelK这3种，最适温度均为Topt＝60～65℃(例如参考非专利文献3～5。)。从嗜热放线菌褐色嗜热裂胞菌(Thermobifidafusca)分离出属于GH6家族的E3(例如参照非专利文献6)和属于GH48家族的Cel48A(例如参照非专利文献7。)这两种纤维二糖水解酶基因。这些纤维二糖水解酶的热稳定性比较高，表现出最大活性的50％的温度范围为40～60℃，并在55℃下至少具有16个小时的稳定活性。然而，这两种纤维二糖水解酶在70℃以上的活性不足，在用它们进行纤维素的糖化处理时，糖化处理温度的上限为60～65℃。据报道，来源于热袍菌属的嗜热菌的纤维二糖水解酶的耐热性最高，最适温度为Topt＝105℃，活性半衰期Thalf在108℃下为70分钟(例如参照非专利文献8。)。然而，该酶表现出内切葡聚糖酶式的底物特异性，并仅对无定形结构的纤维素与羧甲基纤维素(CMC)表现出分解活性。另外，由于滤纸的水解活性弱，无法期待通过该酶对结晶木质纤维素进行有效糖化。现有技术文献专利文献专利文献1：特表第2006-515506号公报专利文献2：特开第2012-39967号公报专利文献3：特开第2005-237233号公报专利文献4：特开第2007-53994号公报专利文献5：特开第2008-193953号公报非专利文献非专利文献1：Ganju等，《Biochim.Biophys.Acta.》，1989年，第993卷，第266-274页。非专利文献2：Hong等，《应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)》，2003年，第63卷，第42-50页。非专利文献3：Zverlov等，《微生物学》，2002年，第148卷，第247-255页。非专利文献4：Zverlov等，《微生物学》，1997年，第143卷，第3537-3542页。非专利文献5：Kataeva等，《细菌学杂志》，1999年，第181卷，第5288-5295页。非专利文献6：Zhang等，《生物化学》，1995年，第34卷，第3386-3395页。非专利文献7：Irwin等，《欧洲生物化学杂志》，2000年，第267卷，第4988-4997页。非专利文献8：Ruttersmith和Daniel，《生化杂志》，1991年，第277卷，第887-890页。非专利文献9：Herai,S.等，《美国科学院院报》，2004年，第101卷，第14031-14035页。非专利文献10：Ogino,S.，《应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)》，2004，第64卷，第823-828页。非专利文献11：Tamura,T.等，《环境生物技术杂志(J.EnvironmentalBiotechnol.)》，2007，第7卷，第3-10页。非专利文献12：DN.Bolam等，《生物化学杂志》，1998年，第331卷，第775-781页。非专利文献13：N.DIN等，1994年，《美国科学院院报》，第91卷，第11383-11387页。非专利文献14：K.Riedel本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下列(A)～(L)中的多肽构成的纤维二糖水解酶催化区域：(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上且不足100％的序列一致性的氨基酸序列构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；(D)由序列号3所示氨基酸序列构成的多肽；(E)由序列号3所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；(F)由与序列号3所示氨基酸序列具有80％以上且不足100％的序列一致性的氨基酸序列构成、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；(G)由序列号5所示氨基酸序列构成的多肽；(H)由序列号5所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；(I)由与序列号5所示氨基酸序列具有80％以上且不足100％的序列一致性的氨基酸序列构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；(J)由序列号7所示氨基酸序列构成的多肽；(K)由序列号7所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；或者(L)由与序列号7所示氨基酸序列具有80％以上且不足100％的序列一致性的氨基酸序列构成的、且至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.27 JP PCT/JP2013/0590281.一种耐热性纤维二糖水解酶，其由(A)序列号1所示氨基酸序列、(D)序列号3所示氨基酸序列、(G)序列号5所示氨基酸序列、或者(J)序列号7所示氨基酸序列组成。2.一种耐热性纤维二糖水解酶，其由序列号19所示氨基酸序列组成。3.一种多核苷酸，其为下列任一种碱基序列的多核苷酸：(a)编码序列号1所示氨基酸序列的碱基序列；(d)编码序列号3所示氨基酸序列的碱基序列；(g)编码序列号5所示氨基酸序列的碱基序列；(j)编码序列号7所示氨基酸序列的碱基序列。4.一种多核苷酸，其由编码序列号19所示氨基酸序列的碱基序列组成。5.一种表达载体，其整合了根据权利要求3或4所述的多核苷酸，在宿主细胞中可表达至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽。6.一种转化体，其是在原核生物中导入有根据权利要求5所述的表达载体。7.一种转化体，其是在真核微生物、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞中导入有根据权利要求5所述的表达载体。8.一种耐热性纤维二糖水解酶的制造方法，在根据权利要求6或7所述的转化体中生产耐热性纤维二糖水解酶。9.一种纤维素酶混合物，其含有根据权利要求1所述的耐热性纤维二糖水解酶、根据权利要求2所述的耐热性纤维二糖水解酶、或者利用根...

【专利技术属性】
技术研发人员：须田汀，大熊二郎，山口明日香，广濑佳嗣，近藤康弘，加藤友彦，柴田大辅，
申请(专利权)人：本田技研工业株式会社，公益财团法人上总DNA研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP