一种检测ERCC2基因多态性的引物与方法技术

本发明专利技术提供一种检测ERCC2基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明专利技术属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供的引物可以实现ERCC2基因多态性的特异性检测，准确性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种检测ERCC2基因多态性的引物与方 法。
技术介绍
铂类抗癌药物，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等，是目前临床应用中对多种癌症具 有较高活性的抗癌药物，主要通过引起细胞内DNA损伤来清除癌细胞。 切除修复交叉互补基因l(ERCCl)，为人类DNA损伤修复基因，位于染色体 19ql3. 2-13. 3。切除修复交叉互补基因2(ERCC2)，参与核苷酸切除修复和基因转录，在DNA 损伤修复中起着重要作用。 现有研究数据显示，ERCC1_C118T C/C，C/T，T/T基因型频率分别约为52. 6%， 43. 1%，4. 2% ;ERCC2_L751Q K/K，K/Q，Q/Q 基因型频率分别约为 84. 92%，15. 08%，0%。因此， 通过ERCC2基因多态性的检测，有助于预测铂类药物化疗的预后，在帮助指导用药和个性 化治疗方面具有重要意义。现有技术缺少一种特异性好、灵敏度高、可实现ERCC2基因多态 性检测的引物及其方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测ERCC2基因多态性的引物与 方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了ERCC2基因多态性的检测。本专利技术 检测的位点包括ERCC2_L751Q :c. 2251A>C(p. Lys751Gln) (SNP :rsl3181)。 本专利技术提供一种检测ERCC2基因多态性的引物，包括PCR扩增引 物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ERCC2_L751Q的 上游引物 5'-GGCAAGACTCAGGAGTCACC-3'（SEQ ID N0.1)和下游引物 5'-CCCTCTCCCITTCCTCTGIT-3'（SEQ ID N0.2);所述 SNaPshot PCR 引物包括：针对 ERCC2_ L751Q 的 SNaPshot PCR 引物 5'-TITITTTAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG-3'（SEQ ID NO. 3)。 采用上述技术方案，本专利技术提供的检测ERCC2基因多态性的引物，可以实现ERCC2 基因多态性的特异性检测，准确性好。 相应地，本专利技术还提供一种检测ERCC2基因多态性的方法，包括如下步骤：A)提取 DNA样品；B)采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化； C)采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行 纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。 优选地，所述步骤A )中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :98°C 3min;阶段2: 98°(：1〇8;阶段3:581€3〇8;阶段4:72°(：11^11 ;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6: 72°C 5min;阶段 7:25。(：保温。即，St印 1:98。C for 3minutes;St印 2:98。C for 10 seconds ；Step 3 :58° C for 30 seconds ；Step 4 ：72° C for 1 minute ；Step 5 ：Go to step 2,29 times ；Step 6 ：72° C for 5 minutes ；Step 7 ：25° C forever〇 所述步骤C)中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1 :96°C 10s ;阶段2 : 55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环；阶段5:4°C保温。即，St印 1 ：96° C forlOseconds ；Step 2 ：55° C for 5 seconds ；Step 3 ：60° C for 30seconds ； Step 4 ：Go to step 1,25 times ；Step 5:4° C forever。 优选地，所述步骤D)中，采用GENEMAPPERID V4. 1软件对检测结果进行分析。 此外，本专利技术还提供检测ERCC2基因多态性的引物在制备检测ERCC2基因多态性 试剂中的用途。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测ERCC2基因多态 性的引物，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本专利技术还提供了一种检测 ERCC2基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物， 具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以为铂类药物的临床用药提供指导。【附图说明】 图1本专利技术提供的ERCC2基因引物的扩增片段。 图2 ERCC2基因引物扩增产物的部分测序图。 图3样品的ERCC2基因多态性检测结果图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。 实施例一引物 专利技术人针对ERCC2的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和 比较，筛选出了特异性好的引物。本专利技术提供的引物包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引 物，PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本专利技术提供的所有引物序列均通过 UCSC数据库比对，无已知SNP位点。实施例二引物的特异性 将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting，ERCC2_L751Q引物扩增片段位于chrl9: 45854837+45855007,长度为171bp ;结果如图1所示，引物的扩增片段均覆盖了相应的检测 位点，无其它同源基因。 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显 示，引物扩增片段与ERCC2基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshot PCR 引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对位置及测序反 应掺入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。 实施例二ERCC2基因多态性的检测 提取m)TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自Tiagen，货号：DP318)的说明书，将DNA样品稀释至100ng/yL，备用。 PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购自NEB公司，货号：M0494L)，反 应体系如表2所示，ERCC2_L751Q的引物浓度为5pmol/uL。PCR扩增反应条件包括：阶段1 : 98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2， 29个循环；阶段6 :72°C 5min ;阶段7 :25°C保温。PCR扩增结束后，取2. 0 y L ExoSAP-IT (购自Affymetrix，货号：78205)和3. 0 y L ddH20，混匀，加入PCR扩增产物2. 0 y L，混匀微 离心；在PCR仪中进行酶切反应，程序：37°C，15 min ;80°C，15min ;4°C，保温。采用SNaPshot?Multiplex Kit (购自A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ERCC2基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ERCC2_L751Q的上游引物5’‑GGCAAGACTCAGGAGTCACC‑3’和下游引物5’‑CCCTCTCCCTTTCCTCTGTT‑3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对ERCC2_L751Q的SNaPshot PCR引物5’‑TTTTTTTAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵薇薇，胡昌明，燕启江，郭周萍，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44