具有改善特性的酰基-ACP还原酶制造技术

公开内容涉及酰基-ACP还原酶(AAR)酶变体，当在重组宿主细胞中表达时，其导致改善的脂肪醛和脂肪醇生产。公开内容进一步涉及制备且使用此类AAR变体用于生产具有特定特征的脂肪醇组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善特性的酰基-ACP还原酶本申请要求于2013年1月16日提交的美国临时申请号61/753,273的利益，所述美国临时申请的内容通过引用在此整体并入。序列表本申请含有序列表，其已以ASCII形式电子提交且通过引用在此整体并入。所述ASCII拷贝于2014年1月13日创建，命名为LS00046PCT_SL.txt，并且大小为155,731字节。专利
公开内容涉及酰基-ACP还原酶(AAR)酶变体，当在重组宿主细胞中表达时，其导致改善的脂肪醛和/或脂肪醇生产。公开内容进一步涉及制备且使用此类AAR变体用于生产具有特定特征的脂肪醇组合物的方法。专利技术背景脂肪醇表示工业生物化学品的重要范畴。例如，全世界每年的脂肪醇及其衍生物销售超过10亿美元。这些分子及其衍生物具有众多应用，包括作为表面活性剂、润滑剂、增塑剂、溶剂、乳化剂、软化剂(emollient)、增稠剂、调味料、香料和燃料的用途。由于它们的两亲性质，脂肪醇表现为非离子型表面活性剂，其用于个人护理和家用产品例如去污剂中。较短链的脂肪醇作为乳化剂、软化剂和增稠剂用于化妆品和食品工业中。在自然界中，脂肪醇由酶制备，所述酶能够将多种酰基-ACP或酰基-CoA分子还原为相应伯醇(例如通过引用并入本文的美国专利号8,323,924；8,268,599和8,097,439；以及美国专利公开号20120282663和20100105963)。然而，目前技术主要涉及无机催化剂介导的脂肪酸还原为相应的伯醇。这些脂肪醇经由脂肪酸的催化氢化而产生，所述脂肪酸由天然来源例如椰子油、棕榈油、棕榈仁油、牛油和猪油产生，或通过由石油化学原料产生的α-烯烃的化学水合而产生。衍生自天然来源的脂肪醇具有不同链长，其与特定应用相关且对特定应用特异。脂肪醇脱水为α-烯烃可以通过化学催化来完成。脂肪醛可以用于生产工业特种化学品。例如，醛常用于生产聚合物、树脂、染料、调味剂、增塑剂、香精和药物。醛也可以用作溶剂、防腐剂和消毒剂。某些天然和合成化合物例如维生素和激素是醛，并且许多糖含有醛基。脂肪醇可以通过化学或酶促还原而转换为脂肪醇。脂肪醛和脂肪醇生产的更绿色和更清洁的替代方案是经由可发酵的糖和/或生物质。然而，为了使由可发酵的糖或生物质生产脂肪醇和脂肪醇成为商业上可行的，工业过程必须对于最终产物的有效转换和回收进行优化。本公开内容通过提供组合物和方法而解决了该需要，所述组合物和方法通过使用经改造的宿主细胞作为生物催化剂用于脂肪醛和脂肪醇的改善生产。专利技术概述本公开内容提供了光合和异养宿主细胞，其直接生产特定链长的脂肪醛和/或脂肪醇，从而使得不需要纯化的脂肪酸的催化转换。这种生物学途径提供了更高质量的产品，显著的成本下降和对环境的更少影响。更具体而言，本公开内容提供了新型酰基-ACP还原酶(AAR)酶变体，所述酶变体产生脂肪醛和/或脂肪醇及其组合物。还提供的是特定AAR变体核酸和蛋白质序列，以及包含此类经改造的AAR酶变体的新型重组宿主细胞和细胞培养物。公开内容还提供了使用表达重组AAR变体的宿主细胞的方法，以便制备具有特定特征的脂肪醛和/或脂肪醇组合物。公开内容的一个方面提供了变体酰基-ACP还原酶(AAR)多肽，其催化酰基-ACP转换为脂肪醛，其中所述AAR多肽与下述所示的相应野生型AAR多肽序列具有至少90％序列同一性：SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44，以及在重组宿主细胞中表达变体AAR多肽的方法，导致与通过野生型AAR多肽在相应宿主细胞中的表达而产生的脂肪醛和/或脂肪醇组合物的滴度相比较，脂肪醛和/或脂肪醇组合物的更高滴度。在一个实施方案中，遗传改造的变体AAR多肽与SEQIDNO:28所示的相应野生型AAR多肽序列具有至少90％序列同一性，并且与通过野生型AAR多肽在相应宿主细胞中的表达而产生的滴度相比较，变体AAR多肽在重组宿主细胞中的表达导致脂肪醛和/或脂肪醇组合物的更高滴度，或者C12、C14或C16脂肪醇的更高滴度。在一个方面，变体AAR多肽具有在SEQIDNO:28的氨基酸18、24、31、34、35、43、50、63、86、112、113、116、118、120、135、148、153、155、157、159、168、172、187、188、191、209、210、211、236、277、283、285、291、324、328、335、337和338的一个或多个氨基酸位置处的突变。在一个优选实施方案中，遗传改造的变体AAR多肽具有S18W突变。在另一个优选实施方案中，遗传改造的变体AAR多肽具有S18W突变，并且进一步包含突变例如M21L、D24E、D24Y、L31V、W34F、W35F、D43E、A50Q、C63A、C63G、C63Y、S86G、A112R、S113K、Q116G、R118Q、T120S、A135S、T148C、T148E、T148V、I153P、Q155C、Q155L、T157V、A159V、I168V、C172L、T187V、T188H、T188V、Q191A、L209R、E210Y、A211W、T236C、Q277V、E283G、E283S、A285V、M291V、A324T、A328S、Q335N、L337V和/或L338W。在另一个方面，变体AAR多肽与SEQIDNO:34所示的相应野生型AAR多肽序列具有至少90％序列同一性，并且与通过野生型AAR多肽在相应宿主细胞中的表达而产生的滴度相比较，变体AAR多肽在重组宿主细胞中的表达导致脂肪醛和/或脂肪醇的更高滴度，或者C12脂肪醇的更高滴度。变体AAR多肽具有在氨基酸位置处的突变，所述氨基酸位置包括SEQIDNO:34的氨基酸40、52、58、61、273、303、339、340、344、345、346和588。在一个优选实施方案中，变体AAR多肽具有在氨基酸位置Q40V、G52V、S58V、D61E、G273E、K303G、K339L、H340P、L344A、L344D、L344S、L344T、L345R、V346P、V346G和/或S588V处的突变。公开内容的另一个方面提供了具有如上所述的一个或多个突变的重组宿主细胞，并且其中宿主细胞改造为表达SEQIDNO:28或SEQIDNO:34的变体AAR多肽。当在含有碳源的培养基中在有效表达变体AAR多肽的条件下进行培养时，与通过表达相应野生型AAR多肽的宿主细胞产生的脂肪醛和/或脂肪醇组合物的滴度相比较，这种重组宿主细胞产生滴度大至少10％、大至少15％、大至少20％、大至少25％、或大至少30％的脂肪醛和/或脂肪醇组合物。在一个实施方案中，脂肪醛和或脂肪醇组合物以30g/L-250g/L的滴度，例如至少100mg/L的滴度产生。在另一个实施方案中，脂肪醇组合物细胞外产生。公开内容进一步包含包括如上所述的重组宿主细胞的细胞培养物，其中所述脂肪醇组合物包括C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18脂肪醇，例如C10:1、C12:1、C14:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含与SEQ ID NO:57至少90％序列同一性的变体酰基‑ACP还原酶(AAR)多肽，其中所述AAR多肽催化酰基‑ACP转化为脂肪醛。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.16 US 61/753,2731.一种变体AAR多肽，其中所述变体AAR多肽由SEQIDNO:58的氨基酸序列、SEQIDNO:59的氨基酸序列、SEQIDNO:60的氨基酸序列、SEQIDNO:61的氨基酸序列、SEQIDNO:62的氨基酸序列、SEQIDNO:63的氨基酸序列或SEQIDNO:64的氨基酸序列组成。2.一种重组宿主细胞，其表达权利要求1的变体AAR多肽。3.权利要求2的重组宿主细胞，其中当在含有碳源的培养基中在有效表达所述变体AAR多肽的条件下进行培养时，与通过表达相应野生型AAR多肽的宿主细胞产生的脂肪醇组合物的滴度相比较，所述重组宿主细胞产生滴度大至少10％的脂肪醇组合物。4.权利要求3的重组宿主细胞，其中所述脂肪醇组合物细胞外产生。5.权利要求3或4的重组宿主细胞，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·鲁德，N·特里安，A·席尔默，J·加诺，
申请(专利权)人：REG生命科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US