本发明专利技术公开了一种ermC基因在检测土壤抗生素抗性污染水平中的应用与方法。根据特定抗性基因ermC富集倍数与ARGs总富集倍数间具有极显著的正相关关系(P<0.001)，根据土壤中这种基因的富集水平对土壤抗生素抗性污染的水平进行检测和评价，极大地节约了人力、物力，并能较好地反应土壤抗生素抗性污染水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于土壤环境污染物的检测
，具体涉及ermC基因在检测土壤抗 生素抗性污染水平中的应用与方法。
技术介绍
在人类医学和家畜饲养中，抗生素被广泛用于治疗或预防疾病发生和促进家畜生 长提高产量。然而，摄入人体或动物体内的抗生素很少能被人和动物吸收，大部分抗生素会 排出人和动物体外并随着处理后污水的排放和人畜粪便作为肥料使用而扩散到土壤中，使 土壤环境成为一个巨大的潜在的抗生素抗性基因 （Antibiotic Resistance Genes, ARGs) 储存库。越来越多的证据表明抗生素在环境中的释放和扩散会对土壤微生物施加选择性压 力，从而导致携带ARGs的微生物数量显著增长。最近发表的世界卫生组织的研究警告说 "抗生素抗性细菌正在全世界的许多地方尤其是中国流行，这将可能导致人和动物罹患脑 膜炎和使皮肤、血液、肾脏和其他器官受到感染"。 携带ARGs的微生物菌株死亡后，包含ARGs的DNA分子可释放到环境中长期存在， 并可能通过直接接触或食物链迀移等多种途径进入人体，增加人体的抗生素耐药性，使细 菌感染性疾病的治疗更为困难。此外，由于基因污染比较特殊，它可以通过可移动遗传元件 介导的水平基因转移机制在相似细菌以及病原菌和非病原菌间无限制地传播，而且具遗传 性，很难控制和消除，一旦形成将对人类健康和生态系统安全造成长期、不可逆的危害。因 此，评价土壤抗生素抗性污染水平已成为国际关注的热点。 由于ARGs主要由土壤中的各类耐药微生物所携带，因此检测土壤抗生素抗性污 染水平可从抗性微生物数量和抗性基因丰度两方面进行检测，对应的检测方法分别为：抗 性微生物培养法和抗性基因定量PCR扩增法。抗性微生物培养法评价土壤抗生素污染水 平主要通过抗性微生物占总可培养微生物的比例来表示；抗性基因定量PCR扩增法，主要 通过抗性基因占总细菌16S rRNA基因丰度的比例来表示。由于土壤中只有0. 1~10%的 微生物是可培养的，因此抗性微生物培养法评价土壤抗生素抗性污染水平的准确性受到质 疑。抗性基因定量PCR扩增法能够避开微生物培养法的缺陷，通过直接从土壤中提取DNA， 并对目的基因片段进行扩增和根据扩增过程中的荧光强度对基因丰度进行准确定量，从而 在抗生素抗性污染分析中受到了广泛采用。然而土壤中的抗生素抗性污染常常涉及多种 抗生素，因此要想准确评价总的土壤抗生素抗性污染，需要通过高通量定量PCR的方法对 数十种乃至几百种基因进行扩增，通过对拟评价土壤与对照土壤中经细菌丰度校正后的各 类ARGs的丰度进行比较分析，分别计算出拟评价土壤中每一种抗性基因的富集倍数，所有 ARGs富集倍数的加和可反应土壤总的抗生素抗性污染水平。但这种检测方法涵盖的抗性基 因数量巨大，因此花费成本高，且耗时耗力，不利于大规模推广。 -种省时、廉价和准确的土壤抗生素抗性污染水平检测方法对于评价人类所面临 的潜在抗生素抗性污染风险和实施阻止抗生素抗性传播的策略是非常关键的。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提供ermC基因在检测土壤抗生素抗性污 染水平中的应用与方法。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 基因 ermC在检测土壤抗生素抗性污染水平中的应用。 上述的应用是通过基因 ermC的富集倍数与ARGs总富集倍数之间的正相关体现 的。 所述基因 ermC的富集倍数与ARGs总富集倍数之间的关系：y = 734. 623+2. 606x， 其中X为ermC富集倍数，y为ARGs总富集倍数。 -种利用基因 ermC检测土壤抗生素抗性污染水平的方法，具体包括以下的步骤： (1)选用正向引物序列如SEQIDNo. 1和反向引物序列如SEQIDNo. 2， ermC-F' -TTTGAAATCGGCTCAGGAAAA-3' /ermC-R 5' -AT GGTCTATTTCAATGGCAGTTACG-3 ' 对目的抗性基因 ermC 进行 PCR 扩增； ⑵切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化 感受态大肠杆菌细胞，涂LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板后挑选阳性克隆子，通过基因测序确定 携带目的基因的阳性克隆子，并用含有氨苄的LB培养液对其进行扩大培养； (3)检测从含有氨苄的LB培养菌液中提取的质粒的浓度，换算出单位体积质粒所 携带抗性基因的拷贝数，将含有目的基因的质粒按10倍梯度进行系列稀释，作为抗性基因 标准品； (4)提取土壤DNA，土壤DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增ermC基因， 根据ermC基因的富集倍数和公式y = 734. 623+2. 606x，其中X为ermC富集倍数，y为ARGs 总富集倍数，进而得出土壤抗生素抗性污染水平。 所述目的抗性基因长度分别为：ermC基因的长度是84bp。 所述步骤（1)中的PCR扩增反应体系为25 μ L，其中包括2 μ L的模板 DNA (I-IOng)，各 0.5 yL 的正、反向引物（10 μ Μ)，12.5 yL 的 2 XPremix Ex Taq?(大连宝 生物公司）和9. 5 μ L的无菌双蒸水；PCR扩增条件为：95°C预变性IOmin ;40个循环的95°C 保持20s (变性），60°C保持20s (退火）和72°C保持30s (延伸）；72°C保持5min(完全延 伸）。 所述步骤（2)中的转化感受态大肠杆菌细胞具体步骤为：从-80°C冰箱取出感受 态细胞，冰上解冻5min，轻敲混匀后转移40 μ L感受态细胞至连接反应管，轻击离心管混匀 并于冰上放置20min，之后在42°C水浴45-50s，然后迅速转移至冰上放置2min，加入950 μ L 的SOC培养液至连接反应管，在37°C振荡培养（150转/分）1. 5小时，然后将每个转化培养 基100 μ L涂到两个LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上，将平板于37°C过夜培养（16-24小时）， 取出平板后放4°C显色10h，挑选白斑菌落。 所述步骤（3)中，质粒浓度换算成每yL质粒溶液中目的基因的拷贝数的公式为： 质粒浓度（ng/μ L) X 6. 02 X IO23/。 一种检测土壤抗生素抗性污染水平的试剂盒，其检测基因为ermC，包括引物：正 向引物序列如SEQIDNo. 1和反向引物序列如SEQIDNo. 2,将土壤DNA和抗性基因标准品同时 进行定量PCR扩增ermC基因，根据ermC基因的富集倍数和公式y = 734. 623+2. 606x，其中 X为ermC富集倍数，y为ARGs总富集倍数，进而得出土壤抗生素抗性污染水平。 本专利技术的有益效果： 根据特定抗性基因 ermC富集倍数与ARGs总富集倍数间具有极显著的正相关关系 (P〈0. 001)，根据土壤中这种基因的富集水平对土壤抗生素抗性污染的水平进行检测和评 价，极大地节约了人力、物力，并能较好地反应土壤抗生素抗性污染水平。【附图说明】 图1为ermC基因富集倍数与ARGs总富集倍数之间的关系。【具体实施方式】 下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步说明。 从14个地点采取公园土，其中6个公园是用污水处理厂出水进行灌溉的，6个公 园是用新鲜水灌溉的，2个未受本文档来自技高网...
【技术保护点】
基因ermC在检测土壤抗生素抗性污染水平中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩雪梅，陈莹，李合莲，梁玉，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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