一种FFPE样本的FISH预处理方法以及预处理液技术

本发明专利技术公开了一种FFPE样本的FISH预处理方法以及预处理液，该预处理液包括：预处理液I：EDTA溶液、柠檬酸缓冲液、硫氰酸钠溶液中的至少一种；预处理液II：浓度0.01-0.5％滂胺天蓝、浓度0.025-1％台盼蓝中的至少一种；预处理液III：浓度0.1-5％硼氢化钠；以上均为质量体积比。方法由多个步骤组成。本发明专利技术可以显著降低肝癌FFPE的FISH自发荧光和背景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
，具体地涉及一种肝癌组织石蜡切片(FFPE)样本的FISH预处理方法。
技术介绍
自发荧光是荧光素标记等相关研究中常见的干扰因素，通常由内源的核黄素(Flavin)、NAD⑵H的减少、脂褐素(Lipofuscin)、网状纤维、胶原蛋白和弹性蛋白引起。肝脏、肾脏等代谢旺盛的组织细胞中，存在大量的NADP-NADPH转换现象，同时累积了很多核黄素和脂褐素；在其丰富的血管中，胶原蛋白和弹性蛋白含量也较高，而肝脏中网状纤维居多。这类分子在荧光显微镜下具有较强的自发荧光和背景，严重影响肝组织荧光原位杂交(FISH)的结果。因此，在荧光原位杂交中，需要对肝组织石蜡切片样本进行特殊的预处理，以降低组织自发荧光和背景。现有的石蜡切片样本常用预处理方法，可参考CN201410514904中所述，肺癌组织石蜡切片预处理程序:I)将载玻片浸入2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中5分钟。随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片。2)从福尔马林固定石蜡包埋的肺癌组织中获取多块4微米切片，分别置于以上经氨基丙基三乙氧基硅烷处理过的载玻片上。3)将组织片置于65 °C下过夜烘烤；4)将组织切片浸入二甲苯中室温脱蜡2次。每次10分钟。随后浸入100%乙醇中5分钟。5)将组织切片依次室温下置于100%乙醇，85%乙醇，70%乙醇中各2分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水3分钟，用无绒纸巾试干。6) 500C下用30 % (w/v)酸性亚硫酸钠处理组织切片20_30分钟。7)室温下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 8)取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml2XSSC得到蛋白酶K工作液(200 μ g/ml)。将组织切片浸入蛋白酶K工作液中37°C孵育20-30分钟。9)组织切片经蛋白酶K处理后，于2XSSC中漂洗2次，每次5分钟。10)将组织切片浸入0.1M HCL中室温浸泡5_10分钟。于2XSS溶液中漂洗2次，每次5分钟。11)将组织切片玻片依次浸入_20°C预冷的70%，85%，100%乙醇中各2分钟脱水。12)将组织切片室温浸入丙酮溶液2分钟。13)自然干燥玻片。14)加热玻片至56°C。然而，常用的这种预处理方法，一是本身其处理后的FFPE荧光和背景仍然较为严重；二是其主要针对肺癌，而如前所述，肝癌的干扰因素更多，因此，该方法对肝癌FFPE的效果较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种FFPE样本的FISH预处理方法以及预处理液，以解决现有技术中存在的上述问题。本专利技术提供的技术方案如下:一种用于FFPE样本的FISH预处理液，其特征在于，包括:预处理液1:50-100mM EDTA 溶液；pH 6.8-7.2、5_10mM 柠檬酸缓冲液；pH5.8-6.2、I?5wt%硫氰酸钠溶液中的至少一种；预处理液I1:浓度0.01-0.5界七％滂胺天蓝、浓度0.025_lwt%台盼蓝中的至少一种；预处理液II1:浓度0.1_5被％硼氢化钠；以上百分比均为质量体积比。本专利技术的又一技术方案为:一种FFPE样本的FISH预处理方法，包括如下步骤:(I)烤片:将玻片放在50-60°C烤片机上烤片15-30min ；(2)脱蜡:在通风橱中，将玻片依次浸入3缸二甲苯中，每次8-15min ；(3)去除残留的二甲苯:将玻片依次浸入3缸无水乙醇中，每次晃动几下，将二甲苯去除干净；(4)水化:将玻片依次浸入无水乙醇、85%乙醇、70%乙醇、去离子水，每次0.5_2min ；(5)预处理液I处理:将玻片组织面朝上浸入煮沸的预处理液I中，平稳煮15-25min ；(6)将玻片浸入去离子水中，洗涤0.5-2min ；(7)将玻片浸入PBS溶液，洗涤0.5-2min ;(8)预处理液II处理:将玻片浸入预处理液II中，处理8-15min ；(9)将玻片浸入PBS溶液，洗涤4-6min ;(10)将玻片浸入现配的预处理液III中，处理40_60min ；(11)将玻片浸入去离子水中，洗涤0.5-2min，1-3次；(12)将玻片浸入pH 7.0的2 X SSC溶液中，洗涤0.5_2min ；(13)配成终浓度为0.01-0.lmg/mL的蛋白酶K工作液；(14)将玻片浸入蛋白酶K工作液中，35-40°C消化2_15min，检测消化程度；(15)消化后，将玻片浸入pH 7.0的2 X SSC溶液中，洗涤0.5_2min ;(16)逐步脱水:将玻片依次浸入70%乙醇、85%乙醇、无水乙醇，每次2_4min。在本专利技术中，以上步骤不可打乱，否则难以达到降低背景的目的。其中，步骤(13)方法优选为取100 μ L蛋白酶K溶液(20mg/mL)加入到40mL已预热至37°C的2 X SSC溶液中。其中，步骤(14)每个考普林瓶放置的玻片优选不超过8片。其中，步骤(14)消化程度通过如下方法进行检测:让玻片自然干燥，滴加1yL DAPI复染液，盖上盖玻片后在荧光显微镜下观察消化情况；若消化过度，则应重新实验，并缩短消化时间；若消化不充分，则将玻片浸入2 X SSC溶液中以脱去盖玻片，然后继续消化；若消化适中，则将玻片浸入2 X SSC溶液中以脱去盖玻片，继续以下操作。其中，步骤(5)所述预处理液I包括50-100mM EDTA溶液，pH 7.0、5_10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0、1?5%硫氰酸钠溶液中的至少一种。其中，步骤⑶所述的预处理液II包括浓度0.01-0.5 %滂胺天蓝、浓度0.025-1%台盼蓝中的至少一种。其中，步骤(10)所述的预处理液III为浓度0.1-5%硼氢化钠。本专利技术的优点如下:本专利技术采用预处理液1、I1、III的综合处理体系，再结合特定的操作步骤和参数，可以有效降低FFPE荧光和背景。本专利技术的处理方法对干扰多、难处理的肝癌FFPE尤其有效。【附图说明】图1为实施例1结果对比图，左:常规处理；右:本专利技术I (H)TA溶液)-1I (滂胺天蓝)-1II (硼氢化钠)处理；图2为实施例2结果对比图，左:常规处理；右:本专利技术I (柠檬酸缓冲液)-1I (台盼蓝)-111(硼氢化钠)处理；图3为实施例3结果对比图，左:常规处理；右:本专利技术I (硫氰酸钠溶液)-1I (台盼蓝)-111(硼氢化钠)处理。【具体实施方式】预处理液1:可以是EDTA溶液(50-100mM，pH 6.8?7.2)、也可以是柠檬酸缓冲液(5-10mM，pH5.8?6.2)、还可以是硫氰酸钠溶液(浓度为为I ~5% )，处理时间15_25min ；预处理液I1:滂胺天蓝(浓度0.01-0.5%)，还可以是台盼蓝(浓度0.025-1 % )，处理时间8_15min ；预处理液II1:可以是硼氢化钠(浓度0.1-5%),处理时间40-60min。以上百分比均为质量体积比。以下实施例选取肝癌FFPE组织样本作为测试样本。对比例参照
技术介绍
中的处理程序。实施例1(I)烤片:将玻片放在56°C烤片机上烤片15min。(2)脱蜡:在通风橱中，将玻片依次浸入3缸二甲苯中，每次1min。(3)去除残留的二甲苯:将玻片依次浸入3缸无水乙醇中，每次晃动几下，将二甲苯去除干净。(4)水化:将玻片依次浸入无水乙醇、85%乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于FFPE样本的FISH预处理液，其特征在于，包括：预处理液I：50‑100mM EDTA溶液；pH 6.8‑7.2、5‑10mM柠檬酸缓冲液；pH 5.8‑6.2、1～5％硫氰酸钠溶液中的至少一种；预处理液II：浓度0.01‑0.5％滂胺天蓝、浓度0.025‑1％台盼蓝中的至少一种；预处理液III：浓度0.1‑5％硼氢化钠；以上百分比均为质量体积比。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢皇彬，林清华，唐郑华，纪斌峰，宋庆涛，阮力，
申请(专利权)人：厦门艾德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35