本发明专利技术公开了一种新型诺西肽衍生物及其制备方法。本发明专利技术的特点是以nosO敲除菌发酵产物IM为底物，利用重组nosO和辅助反应液ΔnosO菌株的细胞提取物，进行体外生物转化反应，再分离纯化得到一种新型的诺西肽衍生物，其分子量为1297，分子式C54H51N13O14S6。本发明专利技术提供的诺西肽衍生物具有较多活性基团，可作为中间体用于合成更多具有抑菌活性和水溶性更好的诺西肽衍生物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于新型抗生素及其衍生物生物合成领域，具体涉及采用诺西肽核心吡啶 环合成蛋白NosO体外生物合成一种线性未形成大环结构的新型诺西肽衍生物，以及其纯 化制备和结构鉴定。
技术介绍
自从1928年青霉素被发现以来，抗生素被应用于许多以前致命性的疾病治疗，为 人类健康事业做出了卓越的贡献，据统计资料显示，今天人类的寿命较上世纪初增加了近 20岁之多，其中约有10岁得益于抗生素的使用。但是，也因为抗生素的广泛使用带来了一 些严重问题。微生物对抗生素的抵抗力也随着抗生素的频繁使用变得越来越强，如临床上 已经出现了越来越多的耐药菌株，甚至导致多重耐药菌及超级细菌出现，原本能够治疗的 疾病从新威胁了人类的健康。因此，寻找并开发一些结构新颖、抗菌活性强、市场前景好的 抗生素成为人们的迫切需要。 随着耐药性问题的日益突出，单纯依靠从自然界中筛选新型天然产物变得越来越 困难，已经不能满足各种疾病的治疗需求。在目前已上市的药物中，多数都是由天然产物半 合成后得到的修饰产物发展而成药，纯粹的天然产物成药性是非常低的。但是天然产物的 化学结构十分复杂，采用现有的化学合成与修饰都很难在现有基础上有大的突破。而随着 分子生物技术的不断发展以及第二代测序技术的广泛运用，大量的微生物基因组已经被测 序，越来越多的次级代谢产物的生物合成基因簇被发现，发现新的生物合成机制。通过组合 生物学或合成生物学的方法对很多天然产物的生物合成途径进行改造，产生了一系列的新 的非天然的天然产物，制备结构类似物或许更具有优势。 随着研宄的深入，一类结构新颖，抗菌活性强的抗生素进入人们的视野，它们就是 硫肽类抗生素。硫肽类抗生素是一类由微生物产生，富含硫，高度修饰的环肽类抗生素。硫 肽类抗生素对革兰氏阳性菌具有很强的杀菌作用，在纳克水平上就具有极强的体内外杀菌 活性，而且硫肽类抗生素的抗菌机制与市场现有抗生素的抗菌机制不同，不受现有耐药菌 耐药性的制约。诺西肽作为硫肽类抗生素中唯一成药的两种抗生素之一，结构较简单，已成 为硫肽类抗生素研宄的模式抗生素。诺西肽的生物合成基因簇包括14个结构基因和1个 调控基因。N0SM编码一个13个氨基酸长度的核心肽和33个氨基酸长度的前导肽，最终证 明了诺西肽合成的核糖体起源，它的结构复杂性是由前体肽翻译后修饰引起的。这一系列 的翻译后修饰（PTM)，可以被归纳为3个阶段：（1)核心大环形成前的PTMs ; (2)核心大环的 形成；（3)核心大环形成后特异的PTMs。其中核心吡啶环是硫肽类抗生素的特征标志，它的 形成机制至今仍然无法解释。 体外生物转化反应，是一种在体外进行的，利用体外表达生物合成所需酶或蛋白， 回补到中间产物的体外催化体系中，重新完成原本在生物体内进行的生物合成途径的研宄 方法。这种方法可用来定性生物合成途径中特定酶所起的特定功能，鉴定每一步生物合成 途径的反应底物，也可用于组合生物合成新型衍生物。 因此，本专利技术利用组合生物合成的方法，通过一种全新的体外生物转化方法得到 了一种新型的诺西肽衍生物。这种新型的诺西肽衍生物具有较多的结合修饰位点，可作为 中间体用于合成更多具有抑制细菌生长或杀死细菌活性、更佳水溶性和成药性的诺西肽衍 生物，对抗耐药菌抗生素的开发具有广泛的实用价值和重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种新型诺西肽衍生物及其体外生物转化制备的新方 法，以组合生物合成方式制备自然界不存在的天然产物，相比化学修饰方法低毒、靶向特异 性强。 本专利技术的主要技术方案为：以nosO敲除的活跃链霉菌产生的线性中间体IM为底 物，利用重组表达的NosO进行体外生物转化反应，生成了一种新的诺西肽衍生物，并提取 和结构鉴定。首次发现新型诺西肽衍生物，其分子量为1297,分子式C 54H51N13014S6，其结构式 为：【主权项】1. 一种新型诺西肽衍生物，其特征在于：新型诺西肽衍生物具有下式结构或其药学上 可接受的盐、酯、对映异构体、非对映异构体或混合物：2. 根据权利要求1所述的一种新型诺西肽衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步 骤： (1)采用同源双交换法构建nosO基因敲除活跃链霉菌株，分子生物学手段构建nosO异 源表达表达菌株；(2)以nosO基因敲除活跃链霉菌株的发酵粗提物为底物，利用步骤（1) 中异源表达的NosO进行体外转化反应；（3)将步骤（2)得到的反应产物进行提取纯化和结 构鉴定。3. 根据权利要求2所述的新型诺西肽衍生物的制备方法，其特征在于所述步骤（1)构 建nosO基因敲除菌的方法为属间结合转移法，nosO基因表达菌为大肠杆菌BL21，表达条件 为诱导剂IPTG浓度为0? 001-2mM(优选0? 5mM)，诱导温度为10~37°C(优选20°C)诱导 培养8-24h(优选20小时）。4. 根据权利要求2所述的新型诺西肽衍生物的制备方法，其特征在于所述步骤（2)所 用的催化剂为含NosO蛋白的大肠杆菌破细胞上清，反应辅助液为△nosO菌株细胞提取液， 反应pH为2-10,优选7,反应时间大于2小时，优选24小时。5. 根据权利要求2所述新型诺西肽衍生物的制备方法备，其特征在于步骤（3)使用乙 酸乙酯提取诺西肽衍生物，反相柱纯化获得全新结构的诺西肽衍生物。6. 根据权利要求1所述的诺西肽衍生物作为中间体用于合成更多具有较好抑菌活性 和水溶性更好的新型诺西肽化合物中的应用。【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术的特点是以nosO敲除菌发酵产物IM为底物，利用重组nosO和辅助反应液ΔnosO菌株的细胞提取物，进行体外生物转化反应，再分离纯化得到一种新型的诺西肽衍生物，其分子量为1297，分子式C54H51N13O14S6。本专利技术提供的诺西肽衍生物具有较多活性基团，可作为中间体用于合成更多具有抑菌活性和水溶性更好的诺西肽衍生物。【IPC分类】C12N15-70, C12R1-465, C12N15-76, C12R1-19, A61P31-04, C12P21-02, C07K5-097【公开号】CN104844689【申请号】CN201510198618【专利技术人】陈依军, 许南儿, 吴旭日 【申请人】中国药科大学【公开日】2015年8月19日【申请日】2015年4月23日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型诺西肽衍生物,其特征在于：新型诺西肽衍生物具有下式结构或其药学上可接受的盐、酯、对映异构体、非对映异构体或混合物：。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈依军，许南儿，吴旭日，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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