一种抑制核酸扩增产物污染的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制核酸扩增产物污染的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所提供的方法是利用叠氮溴化丙锭溶液处理污染有核酸扩增产物的环境，再对环境进行曝光处理。利用本发明专利技术所提供的方法能够有效去除被PCR和LAMP等方法扩增出的产物污染的环境，并且经过处理的环境，处理结束后立即就可进行扩增实验，无需等待污染源自身降解，大大缩短了处理时间，同时能有效避免核酸检测过程中假阳性结果的出现。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于基因工程

技术介绍
现如今在食品质量安全检测、临床医学以及法医鉴定中，对于致病菌、目标DNA的 检测大多用核酸扩增的方法，主要为PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增（LAMP)等方法。 而在检测过程中，各检测实验室常被核酸扩增产物的污染所困扰，由于核酸污染所导致的 假阳性结果会造成检测的失败。然而，到如今对于这种污染的预防多数都在于实验室对环 境和设施的严格分区管理和定期的清洁制度。一旦发生了核酸的污染，采取的措施就是对 污染区域用次氯酸钠进行彻底的清洁、2周之内不要做任何的扩增实验或更换实验地点，使 DNA进行自身的降解以达到消除核酸扩增产物造成的污染。这些就是现阶段对于消除核酸 扩增产物污染的有效手段。但是，所需要消耗的费用、人员和时间都很多，不利于检测工作 的进行，并造成了较大的时间和经济损失。 叠氮溴化丙锭（PMA)是biotium公司开发的一种具有高亲和力的光敏DNA绑定染 料。染料本身具有弱荧光的，但是和核酸结合之后荧光性变强。它具有高亲和性并优先结 合到双链DNA上。由于光解作用，染料上光敏的叠氮基转化为高反应性的氮烯基，其易于与 结合部位的任何烃（碳氢化合物）部分反应，形成稳定的共价键的氮-碳键，从而导致永久 性的DNA修饰。染料几乎完全细胞膜不透性，从而可以用于有选择地修饰只从死细胞中暴 露出来的DNA，而远离活细胞中完整的DNA。目前，对PMA的应用主要是去除死菌对检测结 果的影响，还没有利用PMA进行抑制核酸扩增产物污染的报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种抑制核酸扩增产物污染的方法，所采取的技 术方案如下： 本专利技术的目的在于提供一种抑制核酸扩增产物污染的方法，该方法是利用叠氮溴 化丙锭溶液处理污染有核酸扩增产物的环境，再对环境进行曝光处理。 所述方法的步骤如下： 1)利用二甲基亚砜（DMS0)或水溶解叠氮溴化丙锭，配制叠氮溴化丙锭溶液； 2)将步骤1)所得的叠氮溴化丙锭溶液溶解、喷洒或涂抹到污染环境中； 3)对步骤2)经过处理的环境进行曝光处理。 优选地，步骤1)所述配制叠氮溴化丙锭溶液，是利用二甲基亚砜或水溶解叠氮溴 化丙锭至浓度2mM以上。 优选地，步骤2)所述将叠氮溴化丙锭溶液溶解喷涂污染环境中，抑制PCR产物时， 叠氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在〇. 〇3mM以上。 优选地，步骤2)所述将叠氮溴化丙锭溶液溶解喷涂污染环境中，抑制LAMP产物 时，叠氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在〇. 148mM以上。 优选地，步骤3)所述曝光处理，是在光强11151ux-1115001ux下，处理0.5-30min。 更优选地，所述曝光处理，是在光强1115001ux下处理30s。 更优选地，所述曝光处理，是在光强11151ux下处理30min。 所述方法的具体步骤如下： 1)利用二甲基亚砜溶解叠氮溴化丙锭至浓度为2mM，获得叠氮溴化丙锭溶液； 2)将步骤1)所得的叠氮溴化丙锭溶液溶解、喷洒或涂抹到污染环境中，其中，在 抑制PCR产物时，叠氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在0. 03mM以上，在抑制LAMP产物时，叠 氮溴化丙锭溶液工作时的浓度在0. 148mM以上； 3)在光强1115001ux下处理30s。 所述方法用于预防和消除实验室或工厂中的核酸扩增产物的污染。 优选地，所述方法，的具体步骤如下： 1)利用二甲基亚砜溶解叠氮溴化丙锭至浓度为2mM，获得叠氮溴化丙锭溶液； 2)将步骤1)所得的叠氮溴化丙锭溶液溶解、喷洒或涂抹到污染环境中； 3)在光强1115001ux下处理30s; 4)处理结束后，利用无污染的水清洗或喷涂污染环境后，在光强1115001UX的条 件下处理30min，以消除残留PMA对日后实验可能的影响。 本专利技术的原理在于，由于PMA结构中带有一个叠氮基团（_N3)，在光激发下脱去 (_N2)形成活跃的氮宾中间体，能与DNA形成永久性的共价键（-NH-CH，)，使DNA不能发生 扩增反应。 本专利技术所取得的有益效果如下： 1.本专利技术所提供的方法可以有效的抑制PCR、实时荧光定量PCR(resl-time PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增技术（NASBA)、链置换扩增（SDA)技术和环 介导等温扩增（LAMP)技术等核酸扩增方法中所产生的污染，解决了阳性核酸扩增产物对 日后核酸扩增实验的干扰问题，能够很好的抑制核酸扩增过程中，假阳性结果的出现。 2.本专利技术所提供的方法，操作步骤十分简单方便，耗时也很短。本专利技术所提供的方 法省略了现有技术在黑暗中孵育的步骤，也可以获得良好的技术效果。同时，利用本专利技术所 提供的方法处理过的环境，处理结束后立即就可进行扩增实验，无需等待污染源自身降解， 大大缩短了处理时间。 3.在本专利之前，叠氮溴化丙锭主要是对活菌和死菌进行区分，细菌的DNA常为 低卷曲的负性超螺旋结构。现有技术仅能说明叠氮溴化丙锭可以与这种低卷曲的负性超螺 旋结构DNA进行结合，并产生抑制作用，却尚无研宄证明叠氮溴化丙锭对经过LAMP扩增以 后形成的具有不同个数茎环结构和多环菜花样结构的DNA也可以起到抑制作用。本专利技术所 提供的方法实现了对环介导等温扩增（LAMP)技术所产生的特殊的茎环状结构扩增产物的 抑制，能够避免污染LAMP扩增产物所引起的假阳性结果。【附图说明】 图1为实施例2中PMA对LAMP产物的污染的抑制效果；(M:Marker;1:阳性；2-7:暗孵育时间分别为Omin;lmin;2min;3min;4min; 5min;8 :阴性）。 图2为实施例3中不同光源的灯光对核酸产物抑制效果的影响；(M:Marker; 1 :阳性；2 :光照强度为1115lux的白炽灯光照；3 :光照强度为 11151UX的卤素灯光照；4 :阴性）。 图3为实施例4中DMSO对于LAMP产物污染抑制效果的影响；(M :Marker;1 :2ul2mMPMA处理LAMP产物；2 :2ulDMSO处理LAMP产物；3 :阳 性）。 图4为实施例5中PMA对LAMP产物的抑制效果；(M:MarkerD2000 ;1:阳性当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制核酸扩增产物污染的方法，其特征在于，是利用叠氮溴化丙锭溶液处理污染有核酸扩增产物的环境，再对环境进行曝光处理。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，满朝新，赵玥明，姜霞，周文琦，
申请(专利权)人：黑龙江省乳品工业技术开发中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23