一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法技术

一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，属于分子生物学领域，本发明专利技术方法利用4％多聚甲醛溶液处理皮肤表面，能够得到更纯的皮肤RNA。该方法所需费用极低，材料易得，操作简便，效果显著。利用本方法可快速、高效的获得半滑舌鳎皮肤组织，用于获取高质量的皮肤RNA；为半滑舌鳎皮肤功能基因的相关研究提供了重要且可靠的分子实验材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体地涉及一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法。
技术介绍
半滑舌鳎(Cynoglossus semi laevis Gilnter)是我国第一种进行人工养殖的舌鳎科鱼类，俗称牛舌头、鳎目、鳎米、龙利，属鱗形目Pleuronectiformes、舌鳎科Cynoglossidae,自然分布于我国沿海海区，以渤海、黄海为多，栖息于泥沙质海底，是一种名贵的底栖大型鱼类，目前，由于具有良好的市场经济价值，有“富贵鱼”、“海洋中的黄金”之称。但是半滑舌鳎的摄食习性非常特殊，习惯夜间摄食，对颗粒饲料采取底匍摄食，明显不同于鲆鲽类养殖品种牙鲆和大菱鲆等采取投喂后主动从池底跃起摄食的习性。这种特殊的摄食行为，使人工养殖条件下的投喂非常困难，摄食差、死亡率高并表现出生长缓慢现象，这已成为制约半滑舌鳎推广养殖的瓶颈。因此，探索半滑舌鳎的摄食行为，对于促进其摄食以及为其他鳎科鱼类的养殖开发提供借鉴，都具有重要的理论意义和经济意义。近年来，半滑舌鳎摄食行为和感觉生理成为研宄热点。前期研宄表明半滑舌鳎的侧线系统在摄食行为中起主导作用。半滑舌鳎的侧线系统是由覆盖在有眼侧皮肤的管道神经丘和只分布在无眼侧头部皮肤的游离神经丘两部分组成，而半滑舌鳎的活体皮肤具有管道神经丘以及游离神经丘，是从分子水平探索半滑舌鳎摄食行为和感觉生理的重要实验材料。目前，很多研宄都针对改良RNA的提取方法，对前处理方法涉及很少，有关半滑舌鳎皮肤组织的获取的探索研宄更是少之又少。研宄发现半滑舌鳎皮肤黏液腺发达，各黏液腺通过黏液分泌管相互连结，并通过无数个开孔通向皮肤表面，致使鱼体半滑舌鳎皮肤表面覆盖厚厚的粘液，同时肌肉剥离困难，易混入肌肉中的RNA，因此要从半滑舌鳎鱼体中获取单一皮肤组织存在很多困难，。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，该方法所需费用极低，材料易得，操作简便，效果显著。利用本方法可快速、高效的获得半滑舌鳎皮肤组织，用于获取高质量的皮肤RNA ;为半滑舌鳎皮肤功能基因的相关研宄提供了重要且可靠的分子实验材料。一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，包括以下步骤(I)首先用I XPBS缓冲液清洗鱼体表面，去皮肤表面覆盖的粘液；(2)在选取的皮肤部位，利用解剖刀切入深度为1.8-3.0mm方块，所述方块面积大约为0.25-4cm2，且不要脱离鱼体；(3)利用移液枪向步骤⑵中1.8-3.0mm深的方块四周裂口处注满4%多聚甲醛溶液，固定处理lmin-4min ；(4)然后吸取4% (g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所处理的方块皮肤表面，固定处理 30s_lmin ；(5)选取方块的一角，用镊子直接撕取该组织块表面皮肤，获取的皮肤组织能够直接用于RNA的提取或冷冻保存。本专利技术与现有技术相比的有益效果:1、本专利技术所需材料主要是IXPBS缓冲液和4%多聚甲醛溶液，材料易获取，需用量极少，费用较低。2、本专利技术首次利用固定液的固定特性，第一能够有效去除半滑舌鳎皮肤表面的粘液蛋白，并减少其分泌；第二能够使肌肉组织固定变硬，致使皮肤组织与肌肉组织剥离，可以干净快速获取半滑舌鳎单一皮肤组织。与常规方法相比一方面能够简易快速获得皮肤组织，而且有效减少了粘液蛋白含量，能够显著降低了皮肤RNA降解；另一方面皮肤中不会残留肌肉组织，能够得到更纯的皮肤RNA，获得更可靠的后续实验结果。3、本专利技术首次利用4% (g/100ml)多聚甲醛溶液能够更好的保存RNA完整性的特性，短时间内基本不会破坏RNA的完整性，能够获得高质量的RNA。【附图说明】图1:本专利技术方法提取的RNA电泳图。图2:本专利技术方法与常规方法获取半滑舌鳎皮肤组织提取RNA比对效果图:1，、2，、3、4代表常规方法提取的RNA ;5和6代表本专利技术方法提取的RNA。【具体实施方式】下面通过实施例来对本专利技术的技术方案作进一步的改进，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。实施例一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，具体方法如下(本实验所需试剂和耗材均需RNA-free，所用的鱼为刚刚死亡的半滑舌鳎，体长37cm，体重750g)；(I)首先用I XPBS缓冲液清洗鱼体表面，此步骤尽量除去皮肤表面覆盖的粘液；(2)在选取的皮肤部位，利用解剖刀切入深度为1.8mm方块，所述方块面积大约为Icm2，且不要脱离鱼体；(3)利用移液枪向步骤⑵中1.8mm深的方块四周裂口处注满4%多聚甲醛溶液，固定处理Imin ；(4)然后吸取4%多聚甲醛溶液滴加到所处理的方块皮肤表面，固定处理30s ；(5)选取方块的一角，用镊子直接撕取该组织块表面皮肤，获取的皮肤组织能够直接用于RNA的提取或冷冻保存。RNA的提取选用天根动物组织总RNA提取试剂盒，具体步骤如下:I)组织匀浆处理取组织20mg加入300 μ L裂解液RL (裂解液RL使用前取I μ L裂解液加入1yL的巯基乙醇配成浓度1%的终溶液)，用研磨杵将组织彻底研磨，然后向匀浆液中加入590 μ L RNase-Free ddH20 和 10 μ L Proteinase K，混勾后 56°C水浴处理 15min，水浴处理时每阿隔5分钟摇晃一次，以便充分热处理；注意:取得组织量确定不要超过20mg，否则过多将会导致RNA提取率和质量下降。2) 12000rpm离心5min，取上清液进行下面的操作；3)缓慢加入0.5倍上清液体积的无水乙醇，混匀，如果此出现沉淀，则将得到的溶液和沉淀一并转入吸附柱CR3中(吸附柱提前放在收集管中)，12000rpm离心60秒，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中；4)向吸附柱CR3中加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111离心60秒，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中；5)配制DNasel工作液:取10 μ L DNasel储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70 μ L的RDD溶液，轻轻混匀；6)向吸附柱CR3中央加入80yL刚配置的DNasel工作液，室温情况下放置15min ；7)向吸附柱CR3中加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111离心60秒，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中；8)向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW(使用前确定已经加入了乙醇)，室温情况下放置2min，12000rpm离心60秒，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管；9)重复步骤8 (向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW，室温情况下放置2min，12000rpm离心60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管)一次；10) 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温下放置8分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注:此步骤的目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留可能会影响后续的RT等实验。11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40 μ L RNase-Free ddH20，室温情况下放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。注意:1、洗脱缓冲液体积即RNase-Free ddH20不应少于30 μ L，用量过少将会影响RNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，其特征在于它包括以下步骤(1)首先用1×PBS缓冲液清洗鱼体表面，去除皮肤表面覆盖的粘液；(2)在选取的皮肤部位，利用解剖刀切入深度为1.8‑3.0mm方块，所述方块面积大约为0.25‑4cm2，且不要脱离鱼体；(3)利用移液枪向步骤(2)中1.8‑3.0mm深的方块四周裂口处注满4％(g/100ml)多聚甲醛溶液，固定处理1min‑4min；(4)然后吸取4％(g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所处理的方块皮肤表面，固定处理30s‑1min；(5)选取方块的一角，用镊子直接撕取该组织块表面皮肤，获取的皮肤组织能够直接用于RNA的提取或冷冻保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马爱军，商晓梅，王新安，夏丹丹，毛美霖，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37