本发明专利技术公开了一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法。它是取待测品种纯合亲本种子各1粒种子、杂交种F1代100粒，单粒提取DNA。每粒种子分别装入2mL圆头离心管中，内放两颗2mm直径钢珠，液氮速冻30秒。采用高通量组织研磨器破碎，频率设定65Hz，时间设定70s。通过添加乙酸钠、增加颠倒混匀次数、离心时间和转速等改进，充分提取DNA。该方法简单快速，不需对种子进行任何处理，提取DNA可以满足SSR法鉴定品种纯度的要求。本发明专利技术的鉴定方法具有检测速度快、成本低、结果可靠的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物育种
，具体涉及一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂 交种纯度鉴定的新方法。
技术介绍
与常规种比较，茄子杂交种具有高产、抗逆和优质等诸多方面的优势。但茄子为严 格自花授粉作物，在杂交制种过程中，由于去雄不及时或去雄不完全，往往产生自交种子， 给生产造成损失。因此，及时进行杂交种纯度检测非常重要。目前，主要方法有： 田间检测：此方法目前为多数茄子种子生产单位选用。茄子苗龄50-60天，定植后 40-50天始收，整个鉴定期100天以上，耗时长。得到鉴定结果后往往已错过当年播种期，导 致库存压力增大，种子芽势降低。 室内DNA检测：目前有R APD、SRAP、SSR标记法对茄子进行纯度检测，但都是采取 叶片，通过传统CTAB提取法DNA。茄子出苗慢，从播种到第一片真叶展开大约30左右，研磨 一个样品至少要30秒，纯度鉴定至少要求群体在100株以上。刘军利用NaOH裂解法提取 茄子种嫩芽DNA进行品种纯度鉴定，提取的DNA中蛋白质和杂质含量较高，琼脂糖电泳并不 能看到明显的DNA条带，而且提取的DNA中有2%-4%的样本不能正常扩增，导致条带缺失， 而茄子发芽也至少需要5-7天。经检索，目前尚未发现通过提取单粒茄子种子DNA快速实 现杂交种纯度鉴定的报道。
技术实现思路
本专利技术公开了一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法，其特 征在于下如下的步骤进行： 1)杂交种母本和父本种子各1粒，F1代100粒饱满健康有活力的种子用于DNA提取； 包括：圆丰园单粒种子、茄子杂交种46-2012单粒种子、茄子杂交种紫帅四号单粒种子。 2)将每粒种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻15-60 秒，采用高通量组织研磨器破碎，参数设定频率为45-100赫兹、时间为30-70秒； 3) DNA提取过程中65°C水浴10_60min，每隔3-8min混匀一次； 4) 采用苯酚抽提和体积比为24:1的氯仿异戊醇抽提，颠倒混匀次数80-100次， 12000rpm转速，离心时间4-10分钟；其中苯酚用量为450ul;优选颠倒混匀次数为80-100 次。 5)取上清200uL，加入等体积异丙醇之前加入20uL3M乙酸钠促进DNA沉淀纯 化； 6) 70% (w/w)乙醇洗沉淀两次，种子DNA量少，洗时尽量避免将DNA沉淀倒掉，留10uL底液室温晾干至无酒精味。 7)加入 20ulddH20 后 65°C保温 15min，混匀，3000rpm转速离心 20-60 秒。 8)取2uLDNA采用天津科润蔬菜研宄所茄子研宄室自有SSR鉴定体系对杂种F1代 进行品种纯度鉴定。 本专利技术采用杂交种母本和父本各1粒（有市售）、茄子F1代100粒饱满健康有活 力的种子用于DNA提取。将不做任何处理的种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm 直径钢珠，液氮速冻30秒后，采用破碎仪破碎，参数设定为65Hz、70s。破碎后用连续加样器 每管添加600uL裂解液65°C温浴30分钟后通过氯仿异戊醇分离得到DNA样品。（氯仿：异 戊醇的体积比为24:1)经过核酸蛋白仪测定浓度后统一调整为50ng/uL，取2uLDNA采用已 知SSR鉴定体系对杂种F1代进行品种纯度鉴定。 本专利技术检测方法的检测对象为茄子F1杂交种。 本专利技术首次实现了对茄子种子DNA直接进行提取的目标。采用一台高通量组织研 磨器(宁波新芝Scientz-48)可在70秒内完成48个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过 去研磨效率至少提高20倍。在改良CTAB法的基础上，通过增加颠倒混匀次数(从20次增 加到100次)、添加3M乙酸钠、最后洗涤时留少许乙醇使其自然蒸发晾干等措施，在单粒种 子中提取到了质量稳定、数量充足的DNA质量，利用自有SSR纯度鉴定体系可在5个小时内 完成茄子杂种纯度鉴定。 本专利技术的原理在于： 小样品提取到足够的DNA，在研磨方法，水浴过程中间隔混匀多次，苯酚抽提，颠倒混匀 次数从20次增加到100次，添加3M乙酸钠，离心时间从4分钟增加到10分钟，以及进行 PCR时间有调整，具体的内容如下： 采用机械研磨的方法研磨充分，可以更好破碎茄子种子的组织和细胞，由于种子细 胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲 液中需加入强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。十六烷基三甲基溴化铵 (hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜 和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。离心管添加CTAB水浴过程中每隔 5min混匀一次，目的是使药品与种子组织和细胞充分接触，尽量实现完全反应。再加入苯 酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA)水溶性很强， 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇 匀100次以上，为的是将除核蛋白之外的其余蛋白杂质溶解在苯酚有机相中，减少对DNA提 取的影响。离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1)轻轻颠倒摇匀100次以上，因为此 时DNA已经与核蛋白分离，DNA较脆弱，如果剧烈摇动会导致DNA断裂，影响提取效果。摇 匀100次以上为的是充分分离DNA，提高DNA提取质量。取上清200uL，加入20uL3M乙酸 钠可以促进DNA沉淀纯化。3M的醋酸钠有H20分子的作用，促进DNA沉淀，PH4. 8的醋酸钠 溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而染色体DNA复性，并聚集成不可溶的 网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子 发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复 合物形式沉淀出来，从而使DNA得到纯化。再加入220uL异丙醇即可将DNA完全沉淀，沉淀 DNA溶于20uLddH20中，65°C保温15min，使DNA得到充分溶解，得到总DNA溶液。防止DNA 量少而出现降解，应该立刻进行PCR扩增，或者-20°C保存。 本专利技术公开的基于茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交茄子品种纯度鉴定的方 法与现有技术相比所具有的积极效果在于： (1)检测速度快：以种子为材料提取DNA可以不受采样时间、地点的限制，也解除了提 取DNA过程中需要液氮研磨的麻烦。通过采用高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48) 可在70秒内完成48个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过去研磨效率至少提高20倍。 (2)成本低：由于DNA提取工作量大大降低，节省人力物力，利用分子标记技术鉴 定一个品种纯度，仅需要500元左右，是所有技术中成本最低的。 (3)提取充分，结果可靠：实验证实，利用本方法提取DNA，速度快，质量高，每粒种 子提取的DNA可供3次电泳，而且条带清晰，纯度鉴定结果与田间纯度鉴定结果吻合。【附图说明】： 图1为圆丰园SSR琼脂糖凝胶电泳； 图2为杂交种46-2012聚丙烯凝胶电泳； 图3为紫帅四号SSR聚丙烯凝胶电泳。【具体实施方式】 为了更充分的解释本专利技术的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：1）取杂交种母本和父本种子各1粒， F1代100粒饱满健康有活力的种子用于DNA提取；2）将每粒种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻15‑60秒，采用高通量组织研磨器破碎，参数设定频率为45‑100赫兹、时间为30‑70秒；3）DNA提取过程中65℃水浴10‑60min，每隔3‑8min混匀一次；4）采用苯酚抽提和体积比为24:1的氯仿异戊醇抽提，颠倒混匀次数80‑100次，12000rpm转速，离心时间4‑10分钟；其中苯酚用量为450ul；5) 取上清200uL，加入等体积异丙醇之前加入20uL 3 M乙酸钠促进DNA沉淀纯化；6)70%（w/w）乙醇洗沉淀两次，种子DNA量少，洗时尽量避免将DNA沉淀倒掉，留10uL底液室温晾干至无酒精味；7）加入20ul ddH2O后65℃保温15min，混匀，3000rpm转速离心20‑60秒；8）取2uLDNA采用SSR鉴定体系对杂种F1代进行品种纯度鉴定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王利英，石瑶，乔军，李素文，王立宾，郑华森，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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