采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法技术

本发明专利技术提供了一种采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法，是基于汾远2号远志的ITS序列，设计出8对可快速检测汾远2号远志的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，可分别扩增出367bp或者463bp的PCR扩增产物，为汾远2号远志的药材鉴别提供了分子鉴定依据。根据该方法可构建检测试剂盒，具有操作简便、特异性好、灵敏度高、无需测序等优点，可实现对汾远2号远志的鉴别。

【技术实现步骤摘要】
采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法
本专利技术涉及远志的分子生物学检测技术，具体地说是一种采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法。
技术介绍
远志来源于远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.和卵叶远志P.sibiricaL.的干燥根，为常用中药，最早记载于《神农本草经》，被列为上品，并被视为养命要药。性温，味苦、辛，具有安神益智、祛痰、消肿的功能，经现代研究发现远志具有抑菌、抗炎,提高认知、改善记忆能力、抗老年痴呆，抗抑郁，抗肿瘤，抗衰老等作用。远志的主要有效成分为皂苷、口山酮、寡糖酯和生物碱等，其中：远志皂苷为远志中祛痰止咳、镇静的主要活性成分；远志中糖酯类成分3，6＇-二芥子酰基蔗糖具有抗抑郁的作用；远志糖酯A、C是远志安神作用的物质基础。近年来，由于远志药材使用量的不断增加及其野生资源的不合理采挖，远志药材的野生贮藏量正逐年下降，已无法满足人们日益增长的需求。从上世纪80年代起，就已经开始了野生远志的驯化及人工种植，目前已形成远志的多个规模化生产种植基地。但是传统中药材的生产种植由于无商品化的种子来源，目前仍处于一个粗放式的、自采自种的原始阶段，因此，目前有必要且急需对现有商品远志进行良种选育，进而为其规模化生产种植提供优良种质资源，使远志药材生产朝着优质、高产、质量稳定、可控的方向发展，实现资源的可持续发展。晋远1号和汾远2号远志(P.tenuifoliaWilld.)是山西省农业科学院汾阳经济作物研究所(以下简称汾阳经作所)选育的两个远志品种。晋远1号和汾远2号在形态学方面比较相近，晋远1号：该品系株高35-45cm，叶色浓绿，鲜根圆株型，长25-30cm，直径0.4-0.8cm，黄白色，粗细较均匀，抗根腐病、耐渍、耐旱性较强，生育期2.5年；汾远2号：该品系株高25-35cm，叶色翠绿，鲜根圆柱形，花果全部集中于顶端。鲜根长28-32cm，直径0.6-0.8cm，粗细均匀，根身与近芦头部位根皮颜色相近，黄白色，生育期2.5年，在以下性状较亲本(洪洞农家种：株高30-35cm，叶色深绿，鲜根圆柱形分枝较多，花果集中于地上部全株，鲜根长25cm-30cm)有明显的区别。但是目前在药材市场中流通的只是远志药材的干燥根，而且存在远志根与筒的不同商品等级(如长短、粗细等)，因此仅仅依靠药材的外形来辨别晋远1号和汾远2号存在着较大困难。有学者曾针对远志的基源和药材进行过深入的研究，传统的鉴定方法包括：基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等，现代的鉴别方法包括：色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。而随着现代分子生物学技术的研究深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增多态DNA(RAPD)分析、间断简单序列重复(ISSR)标记、扩增片段长度多态性(AFLP)分析等技术得到了广泛的应用，但它们也存在着很多的不足。RFLP技术结果稳定，为共显性表达，可以区分杂合、纯和，但对DNA需求量较大且费用昂贵，操作复杂；RAPD具有广泛性和通用性，具有对DNA的质量要求较低、技术简便、检测迅速、灵敏度高、可操作性强等优点，其缺点主要在于它是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子以及共迁移、重复性差等问题。ISSR标记具有快速、简便、多态性高等优点，但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计；AFLP技术具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，但对基因组DNA纯度和内切酶质量要求较高，操作成本也相对较高，且所得到的分子标记多为显性标记。核糖体基因转录间隔区(ITS)序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而适合进行各种分子操作。由于该区域受外界环境因素的影响较小，进化速度快，因而具有种内变异小而种间变异大的特点，是种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，可用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。本专利技术结合以上方法和技术的优点，依据分子标记技术的原理和原则，设计出8对特异性PCR鉴别引物，目的是提出一种特异性鉴别汾远2号远志的分子方法，并希望得到实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可快速、准确地鉴别汾远2号远志的特异性引物对，以及采用该特异性引物鉴别汾远2号远志的方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供的一种用于鉴别汾远2号远志的特异性引物对，所述的特异性引物对是如下(1)至(8)引物对中的任意一对：(1)上游引物F1：5＇CGACCGTTGGACACGTATT3＇下游引物R1：5＇TCGCCCCAAGAGATGTGA3＇(2)上游引物F2：5＇CGACCGTTGGACACGTATT3＇下游引物R2：5＇TCGCCCCAAGAGATCAGA3＇(3)上游引物F3：5＇CGACCGTTGGACACGAATT3＇下游引物R3：5＇TCGCCCCAAGAGATGTGA3＇(4)上游引物F4：5＇CGACCGTTGGACACGAATT3＇下游引物R4：5＇TCGCCCCAAGAGATCAGA3＇(5)上游引物F5：5＇CGACCGTTGGACACGTATT3＇下游引物R5：5＇ACCAAGTATCGCATTTCGC3＇(6)上游引物F6：5＇CGACCGTTGGACACGAATT3＇下游引物R6：5＇ACCAAGTATCGCATTTCGC3＇(7)上游引物F7：5＇CGACCGTTGGACACGTATT3＇下游引物R7：5＇TCGCCCCAAGAGATGAGA3＇(8)上游引物F8：5＇CGACCGTTGGACACGAATT3＇下游引物R8：5＇TCGCCCCAAGAGATGAGA3＇以上引物序列在序列表中依次编号为：SEQIDNO：1至SEQIDNO：18。本专利技术提供的一种采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取远志样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用上述的(1)至(8)引物对中的任意一对引物进行PCR扩增反应；3)用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，有PCR扩增条带者即为汾远2号远志，无PCR扩增条带者则非汾远2号远志。所述的PCR扩增反应体系为：所述的特异性引物对是上述(1)至(8)引物对中的任意一对。所述的引物对的PCR反应条件：第(1)至第(4)对引物对的PCR反应条件均为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，10℃10min；第(5)至第(8)对引物对的PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，65℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃5min，10℃10min。本专利技术基于汾远2号远志的ITS序列，设计出可快速检测汾远2号远志的特异性引物，并在此基础上建立PCR检测体系，为汾远2号远志的鉴别提供了分子鉴定依据。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对汾远2号远志的检测，适于广泛的推广使用。附图说明图1是利用汾远2号远志的特异性引物对1-4对晋远1号远志和汾远2号远志PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-1、2-1、3-1、4-1的DNA模板为晋远1号远志，1-2、2-2、3-2、4-2的DNA模板为汾远2号远志本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别汾远2号远志的特异性引物对，其特征在于所述的特异性引物对是如下(1)至(8)引物对中的任意一对：(1)上游引物F1：5＇CGACCGTTGGACACGTATT 3＇下游引物R1：5＇TCGCCCCAAGAGATGTGA 3＇(2)上游引物F2：5＇CGACCGTTGGACACGTATT 3＇下游引物R2：5＇TCGCCCCAAGAGATCAGA 3＇(3)上游引物F3：5＇CGACCGTTGGACACGAATT 3＇下游引物R3：5＇TCGCCCCAAGAGATGTGA 3＇(4)上游引物F4：5＇CGACCGTTGGACACGAATT 3＇下游引物R4：5＇TCGCCCCAAGAGATCAGA 3＇(5)上游引物F5：5＇CGACCGTTGGACACGTATT 3＇下游引物R5：5＇ACCAAGTATCGCATTTCGC 3＇(6)上游引物F6：5＇CGACCGTTGGACACGAATT 3＇下游引物R6：5＇ACCAAGTATCGCATTTCGC 3＇(7)上游引物F7：5＇CGACCGTTGGACACGTATT 3＇下游引物R7：5＇TCGCCCCAAGAGATGAGA 3＇(8)上游引物F8：5＇CGACCGTTGGACACGAATT 3＇下游引物R8：5＇TCGCCCCAAGAGATGAGA 3＇。...

【技术特征摘要】
1.一种采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法，其特征在于，由以下步骤完成：1)提取远志样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增反应；3)用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，有PCR扩增条带者即为汾远2号远志，无PCR扩增条带者则非汾远2号远志；所述的特异性引物是如下(1)至(8)引物对中的任意一对：(1)上游引物F1：5＇CGACCGTTGGACACGTATT3＇下游引物R1：5＇TCGCCCCAAGAGATGTGA3＇(2)上游引物F2：5＇CGACCGTTGGACACGTATT3＇下游引物R2：5＇TCGCCCCAAGAGATCAGA3＇(3)上游引物F3：5＇CGACCGTTGGACACGAATT3＇下游引物R3：5＇TCGCCCCAAGAGATGTGA3＇(4)上游引物F4：5＇CGACCGTTGGACACGAATT3＇下游引物R4：5＇TCGCCCCAAGAGATCAGA3＇...

【专利技术属性】
技术研发人员：张福生，王丹丹，许晓双，秦雪梅，张丽增，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14