KRAS基因突变检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，提供了一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒。所述方法包括：A、利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别接上接头一和接头二，得文库分子；C、单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物；D、对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。本发明专利技术的方法和试剂盒能够简化实验步骤，提高检测效率。

【技术实现步骤摘要】
KRAS基因突变检测方法及试剂盒
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒。
技术介绍
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它是一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因、了解各种癌症的发展预后、化疗疗效的重要指标。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子（第12、13、61密码子）上，占所有突变的90%以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种突变在胰腺癌、大肠癌、肺癌中的发生率较高。在胰腺癌中。KRAS基因点突变发生率高达90%以上。在现阶段，为了实现对KRAS基因突变的检测，可采用多种方案。其中，利用高通量测序技术实现对KRAS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括KRAS特异性引物，所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

【技术特征摘要】
1.一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括KRAS特异性引物、断裂剂、接头一、接头二、连接酶和连接酶缓冲液；所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，所述可断裂位点为U，所述可切除序列为RNA序列；所述断裂剂为USER酶或RNaseH，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；所述可断裂位点或可切除序列在PCR引物对中所处位置在与待测序样本互补配对区域的5'端，与待测序样本不互补配对；所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；所述接头二用于与所述第一粘性末端所在端的相对端连接，所述接头二为平末端接头或突出末端接头。2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端。3.根据权利要求2所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头一为双链核酸分子，所述第二粘性末端所在链的5’末端含生物素标记；或所述接头二为双链核酸分子，所述单碱基突出末端所在链的5’末端含生物素标记。4.根据权利要求1至3中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所KRAS特异性引物包括SEQIDNO:1-2和SEQIDNO:3-4中的至少一对。5.根据权利要求1至3中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头一由SEQIDNO:9-10组成，接头二由SEQIDNO:11-12组成。6.一种用于非疾病诊断治疗目的的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，所述可断裂位点为U，所述可切除序列为RNA序列；B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，钟茂春，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44