KRAS基因突变检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，提供了一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒。所述方法包括：A、利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别接上接头一和接头二，得文库分子；C、单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物；D、对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。本发明专利技术的方法和试剂盒能够简化实验步骤，提高检测效率。

【技术实现步骤摘要】
KRAS基因突变检测方法及试剂盒
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒。
技术介绍
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它是一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因、了解各种癌症的发展预后、化疗疗效的重要指标。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子（第12、13、61密码子）上，占所有突变的90%以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种突变在胰腺癌、大肠癌、肺癌中的发生率较高。在胰腺癌中。KRAS基因点突变发生率高达90%以上。在现阶段，为了实现对KRAS基因突变的检测，可采用多种方案。其中，利用高通量测序技术实现对KRAS基因突变的检测一般包括以下步骤：一）通过PCR扩增获得含待测定目标区域的核酸分子；二）在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测序文库；三）单分子扩增所得测序文库；4）利用高通量测序技术对单分子扩增产物进行测序，得到目标区域的序列信息。但是，在步骤二）中，为了实现这两种接头分子与含待测定目标区域的核酸分子的定向连接，需要依次进行切割、连接，或连接、切割、连接的反应，且为了保证获得文库分子的纯度，减少非目标产物（两种接头自身或相互之间连接的产物、接头连接位置错误的产物）的生成，在上述2步或3步反应中需要进行1至2次的分离纯化步骤，建库步骤繁杂，效率低。在上述方法基础上进行的KRAS基因突变检测方法步骤繁杂，检测效率低。同样，用于上述方法的KRAS基因突变检测试剂盒同样在测序过程中存在步骤繁杂，检测效率低的问题。因此，需要一种新的KRAS基因突变检测方法及试剂盒，简化实验步骤，提高实验效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种KRAS基因突变检测方法及试剂盒，旨在解决现有技术中步骤繁杂，检测效率低的问题。为了实现专利技术目的，专利技术人提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括KRAS特异性引物，所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。其中，所述试剂盒还包括断裂剂、接头一、接头二、连接酶和连接酶缓冲液；所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端。其中，所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端。其中，所述接头一为双链核酸分子，所述第二粘性末端所在链的5’末端含生物素标记；或所述接头二为双链核酸分子，所述单碱基突出末端所在链的5’末端含生物素标记。其中，所述KRAS特异性引物包括SEQIDNO:1-2和SEQIDNO:3-4中的至少一对。其中，其特征在于，所述接头一由SEQIDNO:9-10组成，接头二由SEQIDNO:11-12组成。为了更好地实现专利技术目的，本专利技术还提供了一种KRAS基因突变检测方法，包括以下步骤：A、利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在扩增产物两端分别接上接头一和接头二，得文库分子；所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、接头一、接头二和连接缓冲液；所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；C、单分子扩增含接头一和接头二的文库分子，得单分子扩增产物；D、对单分子扩增产物进行高通量测序，得目标区域的序列信息。所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识别序列。其中，所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识别序列。其中，所述断裂剂为USER酶、RNaseH或限制性内切酶。其中，所述断裂剂为RNaseH、USER酶或限制性内切酶。其中，每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有两种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，且由这些可断裂位点或可切除序列所形成的第一粘性末端之间不能互补配对。其中，所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。进一步的，步骤A中PCR扩增使用的聚合酶为Taq酶；所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端。其中，所述待测序样本有多个，根据待测序样本的不同分别进行步骤A、B和C；所述接头一和/或接头二上含有标签序列；所述标签序列，用于区分待测序样本。其中，所述目标区域为KRAS基因的Exon2和Exon3；所述KRAS特异性引物为SEQIDNO:1-2和SEQIDNO:3-4。其中，所述接头一由SEQIDNO:9-10组成，接头二由SEQIDNO:11-12组成。由上可知，本专利技术的试剂盒和方法通过对PCR引物的特殊设计，结合能让断裂剂和连接酶同时发挥作用的切割-连接反应体系，使得在检测KRAS基因突变过程中，PCR扩增后的切割和连接反应能在同一反应体系中进行，简化了实验步骤，提高了实验效率。附图说明图1是本专利技术一个实施例中分叉型接头的结构示意图。图2是本专利技术一个实施例中带茎环结构的接头的结构示意图。图3是本专利技术的可断裂位点或可切除序列在PCR引物中所处位置与PCR引物和待测序样本互补配对区域之间的位置关系示意图。图4是本专利技术一个实施例中接头二的结构示意图。图5是本专利技术一个实施例中的步骤A、B的原理示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术提出第一实施例，本专利技术还提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括KRAS特异性引物，所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。需要说明的是，本专利技术的试剂盒中的KRAS特异性引物在对KRAS基因中的目标区域进行扩增后，将可断裂位点或可切除序列带入扩增产物中，使得扩增产物在后续的切割和连接能够在同一个反应体系中进行，简化了KRAS基因突变检测的步骤，提高了检测效率。其中，所述试剂盒还包括断裂剂，所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端。其中，所述试剂盒还包括接头一和接头二，用于分别与KRAS特异性引物扩增而得的扩增产物的两端连接。根据用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中含有可断裂位点或可切除序列的引物种类数量的不同，以下将分别进行阐述。在第一实施例中，用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中均只有一种PCR引物上含有可断裂位点或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括KRAS特异性引物，所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

【技术特征摘要】
1.一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括KRAS特异性引物、断裂剂、接头一、接头二、连接酶和连接酶缓冲液；所述KRAS特异性引物，用于特异性扩增待测序样本中的目标区域，且用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，所述可断裂位点为U，所述可切除序列为RNA序列；所述断裂剂为USER酶或RNaseH，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；所述可断裂位点或可切除序列在PCR引物对中所处位置在与待测序样本互补配对区域的5'端，与待测序样本不互补配对；所述接头一含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；所述接头二用于与所述第一粘性末端所在端的相对端连接，所述接头二为平末端接头或突出末端接头。2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端。3.根据权利要求2所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头一为双链核酸分子，所述第二粘性末端所在链的5’末端含生物素标记；或所述接头二为双链核酸分子，所述单碱基突出末端所在链的5’末端含生物素标记。4.根据权利要求1至3中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所KRAS特异性引物包括SEQIDNO:1-2和SEQIDNO:3-4中的至少一对。5.根据权利要求1至3中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述接头一由SEQIDNO:9-10组成，接头二由SEQIDNO:11-12组成。6.一种用于非疾病诊断治疗目的的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、利用KRAS特异性引物，对待测序样本中的目标区域进行扩增，得扩增产物；用于扩增每个目标区域的KRAS特异性引物中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列，所述可断裂位点为U，所述可切除序列为RNA序列；B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，从而在...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，钟茂春，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44