同时诱导扩增Vα24制造技术

本发明专利技术公开了一种同时诱导扩增Vα

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫细胞体外培养领域，涉及一种由人外周血单个核细胞(PBMC)同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁我国人民健康的重大疾病。治疗恶性肿瘤的传统手段包括手术治疗、放射治疗(简称放疗)和化学治疗(简称化疗)。三种疗法各有局限性:手术治疗不能清除肿瘤的微转移灶，难以取得根治性疗效；放疗具有剂量依赖性毒性、无法有效清除潜在的转移灶，另外，部分病人因为产生放射抵抗而对放疗不敏感，化疗易引起全身免疫抑制，并且部分病人因化疗药物无法有效进入肿瘤组织或病人对化疗药物产生耐药性而影响疗效。目前认为，恶性肿瘤治疗失败的三个主要原因是:局部治疗不彻底，肿瘤出现远处转移以及肿瘤病人免疫系统受到抑制因而无法有效识别和清除残存的肿瘤细胞。由此可见，临床肿瘤治疗迫切需要引入新型的治疗方法。随着对免疫学和肿瘤学研究的不断深入，人们深刻地认识到肿瘤的发生和发展与人体的免疫功能密切相关，从而在手术、放疗、化疗治疗恶性肿瘤之后提出了过继性细胞免疫治疗(Adoptive cellular immunotherapy，ACI)的概念。过继性细胞免疫治疗是将患者自体或异体淋巴细胞在体外用多种细胞因子培养激活或进行基因改造并扩增后产生的一群具有抗肿瘤活性的免疫细胞，回输到患者体内，直接杀伤肿瘤细胞或增强患者自身免疫功能，从而发挥抗肿瘤作用的一种治疗方法。该疗法的优势在于清除手术、放疗、化疗后的残留病灶；减低复发或播散的可能性以提高治愈率；增强病人的免疫机能来提高治愈率；改善病人的生活质量。因其近乎为零的毒副作用，被冠以“绿色疗法”的美誉，现已成为继“手术、放疗、化疗”三大传统治疗后的“第四大疗法”。目前用于过继性细胞免疫治疗的主要有:淋巴因子激活的杀伤细胞(lymPhokine activated killer，LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，CIK)和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、iNKT细胞(invariant Natural Killer T cells，iNKT)等，以其杀伤肿瘤细胞活性高、杀伤谱广等优点，在肿瘤的综合治疗中显示出重要的临床应用价值。自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和iNKT细胞(invariant Natural Killer T cells，iNKT)是天然免疫系统的重要组成成员。其中NK细胞主要分布于外周血中，约占外周血淋巴细胞比例的5％-10％，参与机体抗感染、防止细胞恶变及调节免疫等作用，在抗肿瘤作用中其识别、杀伤靶细胞的方式不同于T淋巴细胞，为“非MHC限制性”，无需肿瘤特异性抗原预先识别即可直接杀伤肿瘤细胞，有效识别并清除带有MHC-I类分子缺陷的细胞或肿瘤细胞，抑制肿瘤免疫逃逸效应；在清除肿瘤细胞的过程中，NK细胞还会表达多种可与MHC或非MHC配体结合的受体，通过传递抑制或活化信号而调节NK细胞活性，同时产生大量与杀伤相关的细胞因子，从而发挥免疫调节作用。而iNKT细胞，是一群介于NK细胞和T细胞间的细胞，细胞表面既表达T细胞受体TCR，也表达NK细胞受体。这种细胞有严格的CD1d限制性，且具有大量释放IL-4和IFN-的能力，iNKT细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应。临床数据显示诱导扩增出的NK细胞、iNKT细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景，对肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、骨癌等均有一定效果。在免疫细胞疗法中主要以培养单一类型的细胞为主，对于同时培养多种类型的免疫细胞，由于适用于每一类型细胞的培养条件相互间不相同，不得不分别对多种细胞类型同时平行地实施培养步骤，从而造成采血量大，操作复杂，成本较高等问题。为了解决现有技术中单一免疫细胞进行过继性细胞免疫治疗杀瘤活性低的问题，进一步提高免疫细胞治疗的效果，需要联合应用2种或2种以上免疫细胞进行治疗，本专利技术可以很好的实现这个目的。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种新的两种免疫细胞同时体外扩增的方法，该方法能够在一个培养系统中，在体外培养条件下，同时获得大量应用安全、纯度较高、活性强的Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供一种同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞方法。根据本专利技术实施例，该方法的步骤为：第0天，取外周血，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将分离得到的PBMC用第一培养基调整PBMC浓度为2×106/ml，制成PBMC细胞悬液，然后往PBMC细胞悬液加入Anti-CD16抗体、-GalCer、IL-2、IL-18和IL-21，之后转入培养瓶中于37℃、5％CO2、100％湿度条件下开始培养，所述第一培养基为含自体血浆的无血清培养基；第1天，细胞培养24小时后加入Anti-CD3抗体，在37℃、5％CO2、100％湿度条件下培养；第3天，往细胞悬液中补加一半体积的第二培养基，所述第二培养基为含自体血浆、IL-2、IL-18、IL-21的无血清培养基；第5天，离心收集细胞，并用所述第二培养基将细胞重悬并调整细胞浓度至1.5×106/mL，转移至细胞培养装置中。继续培养和收获：以后每隔2天取样计数细胞，根据计数结果往所述细胞培养装置中补充所述第二培养基，调整细胞密度为1.5×106/ml，37℃、5％CO2、100％湿度条件下连续培养14～21天后，离心收集获得的Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞。专利技术人惊奇地发现，利用本专利技术的方法仅利用一个培养系统，在体外培养条件下，同时获得大量应用安全、纯度较高、活性强的Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量。此外，根据本专利技术的实施例，本专利技术的方法简单易操作，且成本较低，适于广泛推广应用。其中，需要说明的是，在本申请中所使用的术语“自体血浆”是指，与所述外周血来源相同的供体的血浆。根据本专利技术的实施例，所述第一培养基和所述第二培养基中自体血浆的浓度均为1％-20％体积。根据本专利技术的一具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3‑CD56+NK细胞的方法，其特征在于，步骤为：第0天，取外周血，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将分离得到的PBMC用第一培养基调整PBMC浓度为2×106/mL，制成PBMC细胞悬液，然后往PBMC细胞悬液加入Anti‑CD16抗体、‑GalCer、IL‑2、IL‑18和IL‑21，之后转入培养瓶中于37℃、5％CO2、100％湿度条件下开始培养，所述第一培养基为含自体血浆的无血清培养基；第1天，细胞培养24小时后加入Anti‑CD3抗体，在37℃、5％CO2、100％湿度条件下培养；第3天，在细胞培养液中补加一半体积的第二培养基，所述第二培养基为含自体血浆、IL‑2、IL‑18、IL‑21的无血清培养基；第5天，离心收集细胞，并用所述第二培养基将细胞重悬并调整细胞浓度至1.5×106/mL，转移至细胞培养装置中，继续培养和收获：以后每隔2天取样计数细胞，根据计数结果往所述细胞培养装置中补充所述第二培养基，调整细胞密度为1.5×106/mL，37℃、5％CO2、100％湿度条件下连续培养14～21天后，离心收集获得的Vα24+iNKT细胞和CD3‑CD56+NK细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法，其特征在于，步
骤为：第0天，取外周血，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将分离得到的PBMC用第一
培养基调整PBMC浓度为2×106/mL，制成PBMC细胞悬液，然后往PBMC细胞悬液加入
Anti-CD16抗体、-GalCer、IL-2、IL-18和IL-21，之后转入培养瓶中于37℃、5％CO2、100％
湿度条件下开始培养，所述第一培养基为含自体血浆的无血清培养基；
第1天，细胞培养24小时后加入Anti-CD3抗体，在37℃、5％CO2、100％湿度条件下
培养；
第3天，在细胞培养液中补加一半体积的第二培养基，所述第二培养基为含自体血浆、
IL-2、IL-18、IL-21的无血清培养基；
第5天，离心收集细胞，并用所述第二培养基将细胞重悬并调整细胞浓度至1.5×
106/mL，转移至细胞培养装置中，
继续培养和收获：
以后每隔2天取样计数细胞，根据计数结果往所述细胞培养装置中补充所述第二培养
基，调整细胞密度为1.5×106/mL，37℃、5％CO2、100％湿度条件下连续培养14～21天后，
离心收集获得的Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞。
2.根据权利要求1所述同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法，
其特征在于，所述第一培养基和所述第二培养基中自体血浆的浓度均为1％～20％体积，优
选5体积％。
3.根据权利要求1所述同时诱导扩增Vα24+iNKT细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法，
其特征在于，在所述第一培养基和所述第二培养基中，所述Anti-CD16抗体的终浓度均为
50ng～1mg/ml，优选500ng/mL。
4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬冬云，杨新娟，廖娆君，
申请(专利权)人：深圳源正细胞医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44