一种酮还原酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种酮还原酶突变体及其制备方法，其源于酿酒酵母的野生型酮还原酶，能够使5-羟基-3-氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5-二羟基己酸酯，具有I46V、S127N、Q144K中的一个或多个突变。本发明专利技术的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-100倍，利用该酶可生物催化5-羟基-3-氧代己酸酯以生产对应的顺式3,5-二羟基己酸酯；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体顺式 3,5-二羟基己酸酯无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶突变体及其制备方法
本专利技术涉及酮还原酶突变体及其制备方法，特别涉及一种源于酿酒酵母的酮还原酶突变体及其高效制备方法。
技术介绍
阿托伐他汀钙（商品名LIPITOR由辉瑞公司销售）、罗苏伐他汀钙（商品名CRESTOR由阿斯利康公司销售）以及匹伐他汀（商标名Lipalo由NissanChemical及Kowa公司在日本销售），是重要的降胆固醇他汀类药物。而立体异构纯的顺式3,5-二羟基己酸酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备立体异构纯的顺式3,5-二羟基己酸酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉20小时仅可转化1g/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶催化活性高的酮还原酶及其制备方法。实现本专利技术目的的技术方案是：酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)中天然存在的野生型酮还原酶，能够使5-羟基-3-氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。本公开内容的专利技术人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)产生的野生型酮还原酶(SEQIDNO：2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型KRED酮还原酶”指由源自酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)的野生型酮还原酶基因SEQIDNO：1编码的，并具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶能立体选择地还原5-羟基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以产生对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物(例如5-羟基-3-氧代己酸酯)向产物(例如顺式3,5-二羟基己酸酯)转化率增加的酮还原酶。本专利技术提供一种酮还原酶突变体，其源于酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)的野生型酮还原酶，能够立体选择地还原5-羟基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以产生对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。所述酮还原酶突变体，与SEQIDNO.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变：I46V，S127N，Q144K。上述酮还原酶突变体，优先自序列SEQIDNO.4。全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段)诸如通过助溶标签(如SUMO蛋白)、纯化标签(如结合金属的His标签)和细菌定位信号(如分泌信号)的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。本专利技术提供一种酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-100倍。上述酮还原酶酶基因突变体，其优选自SEQIDNO.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。本专利技术提供一种重组质粒，其优选自SEQIDNO.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠杆菌tac操纵子等。本专利技术提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酮还原酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过recombineering重组工程使载体整合到基因组中。本专利技术提供一种制备酮还原酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。所述步骤（a）为将来自酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQIDNO：1)进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到表达载体（SEQIDNO.5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：F：5'ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGTCTTTCCACCAGCAGTTCTTCA3'；R：5'AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTAAACTTTCTGAGCAGCGTAGTTG3'。类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQIDNO：3)克隆到表达载体（SEQIDNO.5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DH1中。所述步骤（c）为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的第一培养基中，30℃，250rpm过夜培养；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的第二培养基中，于30℃中培养至菌体OD5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养15h。所述第一培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。所述第二培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酮还原酶突变体，其源于酿酒酵母的野生型酮还原酶，能够使5‑羟基‑3‑氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5‑二羟基己酸酯，具有以下特征中的一个或多个突变：I46V、 S127N、Q144K。

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其源于酿酒酵母的野生型酮还原酶，能够使5-羟基-3-氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5-二羟基己酸酯，其序列为SEQIDNO.4。2.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的酮还原酶突变体。3.如权利要求2所述的多核苷酸，其序列为SEQIDNO.3。4.一种重组质粒，其包括表达载体连接权利要求3所述的多核苷酸，所述载体序列为SEQIDNO.5。5.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的重组质粒。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述细胞是大肠杆菌，为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。7.一种如权利要求1所述酮还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(a)构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因，所述宿主细胞为大肠杆菌W311...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32