本发明专利技术涉及一种酮还原酶突变体，其源于开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，具有A94S，F147V，L199P，A202V中的一个或多个突变。本发明专利技术的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-20倍，利用该酶可生物催化将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种酮还原酶突变体，其源于开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefir)的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，具有A94S，F147V，L199P，A202V中的一个或多个突变。本专利技术的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-20倍，利用该酶可生物催化将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。【专利说明】 用于生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体
本专利技术涉及酮还原酶突变体及其在他汀类药物中间体生产中的应用，特别涉及一种源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的酮还原酶突变体及其在手性 (S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯生产中的应用。
技术介绍
阿托伐他汀钙(商品名LIPIT0R由辉瑞公司销售)、罗苏伐他汀钙(商品名CREST0R由阿斯利康公司销售)以及匹伐他汀(商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售)，是重要的降胆固醇他汀类药物。而手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。国内2009年该中间体的产量为400吨，预计未来几年内，国内产量将达到1000吨以上，直接经济效益在数亿元。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备及手性(S) -4-氯-3-羟基-丁酸乙酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉20小时仅可转化lg/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶催化活性高的酮还原酶及其制备方法。 实现本专利技术目的的技术方案是:开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)中天然存在的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)。本公开内容的专利技术人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)产生的野生型酮还原酶(SEQ ID NO:2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型KRED酮还原酶”指由源自开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO:1编码的，并具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物(例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。 本专利技术提供的用于生产(S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，其特征在于，其是源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶,其中，突变是在亲本酮还原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失I个或多个氨基酸，或者在亲本酮还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除I个或多个氨基酸，且与使用亲本酮还原酶相t匕，其酮还原酶活性增强2-20倍。 进一步地，所述突变体具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示:字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸:A94S，F147V,L199P, A202V。 本专利技术提供的酮还原酶突变体,其源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，表现出使底物(例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。所述酮还原酶突变体,与SEQ ID N0.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。 进一步地，所述突变体包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列。 全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段)诸如通过助溶标签(如SUMO蛋白)、纯化标签(如结合金属的His标签)和细菌定位信号(如分泌信号)的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。 进一步地，本专利技术提供上述突变体的编码基因。 进一步地，本专利技术所提供的编码基因，其序列包含SEQ ID N0.3所述的DNA分子。其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。 本专利技术提供一种重组质粒，其序列优选自SEQ ID N0.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠杆菌tac操纵子等。 本专利技术提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酮还原酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过重组工程使载体整合到基因组中。 本专利技术提供一种制备酮还原酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤:(a)构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因；(b)培养并诱导所述基因工程菌；(C)破碎所述基因工程菌、收集粗酶液并进行酶活检测。 所述步骤(a)为将来本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于生产(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，其特征在于，其是源于开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮还原酶，其中，突变是在亲本酮还原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在亲本酮还原酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，且与使用亲本酮还原酶相比，其酮还原酶活性增强2‑20倍。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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