微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法技术

本发明专利技术提出了一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮，包括如下步骤：重组表达载体pMV261-ksh的构建；重组菌株的构建；菌种繁殖及发酵转化。本发明专利技术通过基因工程手段获得3-甾酮-9α-羟基化酶基因(ksh)过表达的基因工程菌株，该菌株经过120h发酵可以使植物甾醇的转化率高达95％以上，具有产率高、副产物少、发酵时间短，且提取简单、污染小、环保压力小等特点，极具工业生产的优势。

【技术实现步骤摘要】
微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法
本专利技术涉及留体类药物中间体的生产方法，特别是微生物发酵生产9α_羟基雄 烯二酮的方法。
技术介绍
9 α -轻基雄烯二酮（9 a -hydroxy androstenedione)简称 9 α -〇Η AD (结构式如 下所示），最早是由诺卡氏菌发酵液中分离得到的一种甾体物质。9α-0Η AD可用于合成皮 质激素、抗雄性激素、抗雌性激素及避孕功能药物，是一种非常重要的留体激素中间体。

【技术保护点】
一种微生物发酵生产9α‑羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α‑羟基雄烯二酮，包括如下步骤：第一步，重组表达载体pMV261‑ksh的构建；第二步，重组菌株的构建；第三步，菌种繁殖及发酵转化。

【技术特征摘要】
1. 一种微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：利用重组耻垢分枝杆 菌发酵转化植物留醇生产9 α -羟基雄烯二酮，包括如下步骤： 第一步，重组表达载体pMV261_ksh的构建； 第二步，重组菌株的构建； 第三步，菌种繁殖及发酵转化。2. 根据权利要求1所述的微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第 一步中： 首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌me2155且带有酶切位点的ksh基因； 其次，将其与克隆载体PMD-18T连接，以获得该基因的大量克隆； 再次，进行双酶切、片段纯化，之后与耻垢分支杆菌表达载体PMV261连接； 最后，将得到的连接体系转入大肠杆菌DH5ci感受态细胞中，得到重组质粒。3. 根据权利要求2所述的微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所 述酶切位点分别为EcoRI和Hindlll。4. 根据权利要求1所述的微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第 二步中，先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的重组质粒电转入到耻垢分枝 杆菌感受态细胞中。5. 根据权利要求4所述的微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所 述耻垢分枝杆菌感受态细胞的制作方法： 将浓度1〇7_1〇9个/ml的耻垢分枝杆菌以10 %的接种量接种于LB液体培养基中，LB液 体培养基中含有重量百分比0. 05%的吐温80,在30°C下培养至0D6QQ = 0. 4-0. 5时，添加终 浓度为1 %的甘氨酸继续培养，当〇D6(?达到0. 8-1. 0时开始制备感受态； 首先，将菌悬液以ll〇〇〇g、4°C离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6 量添加含有重量百分比0.05%吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比 为10%，400(^、41：离心101^11，离心完毕后弃去上层清液 ；以上述方...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩雷，张敏然，张耀勋，周利坤，
申请(专利权)人：宋浩雷，
类型：发明
国别省市：河北;13