5-氮杂胞苷（5-AZAC）促进次生代谢产物积累的新用途制造技术

本发明专利技术提供了一种促进次生代谢产物积累的新方法和5-氮杂胞苷的新用途，涉及生物工程技术领域。其特点在于利用添加一定浓度5-氮杂胞苷诱导子，提高白桦次生代谢产物总三萜和齐墩果酸的积累。本方法的发明专利技术，为利用植物细胞离体培养技术进行工业化大规模生产三萜及齐墩果酸类药物提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】
5-氮杂胞苷(5-AZAC)促进次生代谢产物积累的新用途
:本专利技术涉及5-氮杂胞苷(5-AZAC)处理促进次生代谢产物白桦总三萜和齐墩果酸的积累，属于生物工程
。
技术介绍
:白桦树的叶和外皮中含有重要的三萜类物质(尹静等，2009)。大量研究表明，白桦三萜的药理活性多样，且显示出了与以往药物不同的作用机制(Sun等2002 ;Valentin等2002)，疗效高且毒性低，具有抗肿瘤、抗艾滋病及抗菌、抗病毒、降脂、利胆和保肝等作用(Soler等1996 ；Zhukova等2005 ；Kovalenko等2007)。目前已有以齐墩果酸等为主要成分的药物投入临床使用，作为有潜力的新型药物制剂，具有广阔的应用前景。近年来，利用植物离体培养技术生产有用次生代谢物质的研究取得了很大的进展，然而次生代谢产物的低产现象仍然是制约植物离体培养技术产业化应用的核心问题之一，因此越来越多的研究者开始关注提高次生代谢产物积累量的方法。但到目前为止，植物细胞中次生代谢物的低产问题仍未得到很好的解决。5-氮杂胞苷是一种甲基化抑制剂，医学上常用于肿瘤等疾病的治疗。本专利技术利用5-氮杂胞苷处理，促进白桦次生代谢产物总三萜和齐墩果酸积累。本专利技术的内容:本专利技术的目的在于提供一种促进次生代谢产物积累的新方法和5-氮杂胞苷的新用途。其特点在于利用添 加一定浓度5-氮杂胞苷，提高白桦次生代谢产物总三萜和齐墩果酸的积累。本方法的专利技术，为利用植物细胞离体培养技术进行工业化大规模生产三萜及齐墩果酸类药物提供了一种新方法。实施方案:一、实验材料与方法(I)白桦悬浮细胞培养条件本研究以白桦花药悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于IOOmL B5液体培养基中，培养条件为:120rpm，25°C，光照强度20001x，光周期16h，湿度40 %~50 %，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.2-0.4mg/L6-BA和0.6-0.8mg/L TDZ，蔗糖15_25g/L，酸水解酪蛋白l_2g/L，pH5.5~6.0，121 °C高温高压灭菌20mino(2) 5-氮杂胞苷的添加[0011 ] a.5-AZAC促进白桦三萜积累在白桦花药悬浮细胞生长稳定后，添加0.1-0.3mmol/L5-氮杂胞苷，在第96_120h后收获，测定样品中白桦三萜含量。b.5-AZAC促进齐墩果酸积累以终浓度为0.10.1-0.3mmol/L的5_氮杂胞苷处理白桦花药悬浮细胞，分别于处理后48-72h收获，测定样品中齐墩果酸的含量。(3)白桦三萜的提取与含量测定精密称取0.05g细胞干样，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴Ih后再超声40min，取100 μ L上清液于IOml离心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200 μ L5%香草醛-冰乙酸和800 μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷却。乙酸乙酯定容至5ml后测定其在551nm的吸光值(对照组为200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。总三萜的标准曲线以齐墩果酸为标准品进行绘制，其回归方程为y =43.044x-0.6438，相关系数R2 = 0.997，齐墩果酸在4~32mg/L含量范围内具有良好的线性关系。(4)齐墩果酸的提取及含量测定齐墩果酸的提取方法如下:精密称取0.5g细胞干样，加入25mL盐酸-乙醇溶液(2: 8)，加热回流3h，放冷，摇匀并过滤，精密量取滤液15mL，加蒸馏水15mL，置于80°C水浴上蒸去乙醇，然后用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液并于40°C低温蒸干，加Iml甲醇溶解残渣，并将其用0.45 μ m有机滤膜过滤，此为样品检测液，然后利用高效液相色谱进行检测。高效液相色谱(HPLC)检测条件:用Waters公司600-717-2487色谱系统，色谱柱HiQ sil C18V4.6mmX 250mm ;流动相为乙腈:水=9:1 ;柱温25°C ;灵敏度16AUFS ;流速1.0mT,/miη ;检测波长 210nm,进样 20uL。齐墩果酸线性关系考察:精密吸取浓度为0.5mg/mL的齐墩果酸标准品溶液0.2、0.5、l、2、3、4、5mL，分别置于5mL容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 μ L进样，测定其峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。齐墩果酸回归方程为:y = 107x+33446, R2 = 0.9992。结果表明，齐墩果酸在0.2-5.0 μ g范围内具有良好的线性关系。本专利技术的效果:利用上述的实施方案，一种新型诱导子5-氮杂胞苷促进了白桦花药悬浮细胞中次生代谢产物的积累，结果如下:(I)对次生代谢产物白桦三萜积累的促进效果表明，0.1-0.3mmol/L5-氮杂胞苷处理的白桦花药悬浮细胞中，白桦三萜含量在96-120h时出现最大值，为25.64747mg/gDff,为此时对照组含量的197%。 (2).对次生代谢产物齐墩果酸的促进效果表明，0.1-0.3mmol/L5-氮杂胞苷处理的白桦花药悬浮细胞中，齐墩果酸含量在48-72h达到最高值1.0186mg/gDW，是此时对照组的3.73倍。本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利提出5‑氮杂胞苷促进白桦总三萜及齐墩果酸积累新用途。具体操作技术为：以白桦悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于100mL B5液体培养基中，培养条件为：120rpm，25℃，光照强度2000lx，光周期16h，湿度40％～50％，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.2‑0.4mg/L6‑BA和0.6‑0.8mg/L TDZ，蔗糖15‑25g/L，酸水解酪蛋白1‑2g/L，pH5.5～6.0，121℃高温高压灭菌20min。在白桦花药悬浮细胞生长稳定后，添加5‑氮杂胞苷，添加终浓度为0.10.1‑0.3mmol/L。齐墩果酸含量在48‑72h达到最高值1.0186mg/gDW，是此时对照组的3.73倍。白桦三萜含量在96‑120h时出现最大值，为25.64747mg/gDW，为此时对照组含量的197％。

【技术特征摘要】
1.本专利提出5-氮杂胞苷促进白桦总三萜及齐墩果酸积累新用途。具体操作技术为:以白桦悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于IOOmL B5液体培养基中，培养条件为:.120rpm, 25°C，光照强度20001x，光周期16h，湿度40 %~50 %，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.2-0.4mg/L6-BA和0.6-0.8mg/L TDZ,蔗糖15_25g/L，酸水解酪蛋白l_2g/L，pH5.5~6.0，121°〇高温高压灭菌201^11。在白桦花药悬浮细胞生长稳定后，添加5-氮杂胞苷，添加终浓度为0.10.1-0.3mmol/L。齐墩果酸含量在48_72h达到最高值1.0186mg/gDff,是此时对照组的3.73倍。白桦三萜含量在96_120h时出现最大值，为25.64747mg/gDff,为此时对照组含量的197%。2.根据权利要求书I所述的方法，其中的液体培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡锁，詹亚光，李蕾蕾，辛颖，何之龙，周珊，徐速，
申请(专利权)人：东北林业大学，曾凡锁，詹亚光，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23