本发明专利技术提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的单胺氧化酶，以及使用该酶进行酶催化合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-2-取代-3-氮杂双环[3.1.0]己烷或(1S,3aR,6aS)-1-取代-八氢环戊[c]吡咯，进而进一步合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈及其水解产物(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯，或进一步合成(1S,3aR,6aS)-八氢环戊[c]吡咯-1-腈的酶-化学合成方法。还提供了编码该单胺氧化酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法。本发明专利技术的单胺氧化酶可以分别接受3并5和5并5等两种大小不同的氮杂环戊胺体系，生成相应亚胺；亚胺产物可接受氰化物的加成，因此可以在酶催化体系中加入氰化物，加成产物直接在盐酸-醇溶液中醇解得到氨基酸甲酯的盐酸盐，从而实现一锅法投料，简化了反应工艺，更加适合工业化生产的进行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种单胺氧化酶，含有该酶编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该单胺氧化酶作为催化剂在合成博西普韦中间体中的应用。
技术介绍
博昔普韦(boceprevir)及特拉匹韦(telaprevir)是丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂，其化学结构式如下所示：Ⅲ期SPRINT-2研究显示，与标准治疗相比，24周的博昔普韦标准治疗可提高HCV基因1型初治患者的SVR率。博昔普韦标准治疗24周与博昔普韦标准治疗44周的抗病毒疗效相似。片段A是合成博昔普韦的关键中间体之一，片段A的结构如下：目前关于片段A主要有如下合成路线：路线1：WO2007075790公开了利用6,6-二甲基-3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮将内酯内酰胺化、羰基还原、还原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的盐，具体反应路线如下所示：由于此路线中的氰基加成利用了硝酸银、氰化钾和盐酸，成本较高，对于后处理和三废处理也带来了很大困难，不利于工业化生产。路线2：文献(JournalofMedicinalChemistry,2006,Vol.49,No.20,6074-6086)中公开了一种以3-苯基四氢吡咯[1,2-c]恶唑-5(1H)-酮为原料，经过去氢、环丙烷化、开环、还原、氧化等一系列反应得到关键片段A，具体反应路线如下所示：由于此路线中的还原反应采用了氢化锂铝和钯碳，反应条件苛刻，后处理较为繁琐，也不利于工业化生产。路线3：WO2004113295公开了使用6,6-二甲基-3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮为原料，经过醇解、酰胺化、还原酰胺基和酯基、将氨基保护后氧化醇成醛、成环、氰基化、水解、去保护得到片段A的盐酸盐，具体反应路线如下：虽然此路线具有起始原料价廉易得优点，但该路线在制备(1R,3S)-3-氨甲基-2,2-二甲基环丙烷基甲醇时需采取二级还原反应，即，首先利用选自铝烷、在三甲基硅烷基氯存在下的硼氢化锂或硼氢化钠还原酯基，再使用氢化铝锂或三乙酰氧基硼氢化钠还原酰胺基，上述还原反应条件剧烈，温度要求苛刻，反应时间较长，后处理繁琐，安全性低，以致影响了该路线的工业化应用。路线4：文献(J.Am.Chem.Soc.2012,134,6467-6472)公开了利用来自黑曲霉(Aspergillusniger)的单胺氧化酶的消除-加成反应制备(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2-腈的方法，如下所示：该方法通过单胺氧化酶将前手性的胺氧化为手性亚胺，在NaHSO3存在的条件下生成加成产物；后者与NaCN反应得到手性的亚胺加成产物(如上图)，后者甲醇解得到氨基酸甲酯盐酸盐。该法立体选择性地构建了3个手性中心，比化学方法简便、易于操作、对环境友好；但是亚胺产物易挥发且闪点较低，需要额外加入NaHSO3，步骤较为繁琐。片段B是合成特拉匹韦的关键中间体之一，片段B的结构如下：目前关于片段B的合成路线主要有如下路线：路线1：EP0600741公开了如下路线：由于由该路线合成得到的目标物存在于油状混合物中，需经过硅胶柱层析分离才能得到纯品，不仅后处理繁琐，而且无法实现规模化生产。路线2：WO0218369公开了如下路线：由于该路线采用DIBAL-H还原，不仅试剂成本较高，而且制备条件苛刻(需在-78℃下反应)，因此此路线也不适合于工业化生产要求。路线3：CN101463001中公开了如下路线：该路线使用了剧毒的羰基钴，不仅成本太高，而且无法满足环保要求，因此该路线也不能满足产业化要求。路线4：WO2008090819公开了如下路线：由于该路线的起始原料难以合成、不能批量购得，因此也不适合工业化生产要求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对已报道的制备博西普韦中间体片段A和特拉匹韦中间体片段B的反应中收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者对环境不友好等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的单胺氧化酶进行酶催化合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-2-取代-3-氮杂双环[3.1.0]己烷或(1S,3aR,6aS)-1-取代-八氢环戊[c]吡咯，进而进一步合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈及其水解产物(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯，或进一步合成(1S,3aR,6aS)-八氢环戊[c]吡咯-1-腈的酶-化学合成方法。还提供了编码该单胺氧化酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该单胺氧化酶在催化胺氧化反应中的用途。本专利技术通过下述技术方案以解决上述技术问题：本专利技术的第一方面提供了一种分离的单胺氧化酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：(a)由SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质由来源于环境的DNA编码，具有单胺氧化酶的功能，是一种新的单胺氧化酶。(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有单胺氧化酶活性的蛋白质。其中，所述的“几个”是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本专利技术人发现这样的融合蛋白同样具有单胺氧化酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有单胺氧化酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本专利技术的专利技术目的。根据本专利技术，在如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持单胺氧化酶活性。(c)与(a)的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有单胺氧化酶活性的蛋白质。专利技术人将SEQIDNO:2所示的单胺氧化酶序列与其他已知单胺氧化酶进行序列比对，与土曲霉(Aspergillusterreus)单胺氧化酶之间的同一性为93％，与来自黑曲霉(A.niger)的单胺氧化酶的同一性低于80％。本专利技术的单胺氧化酶与已知单胺氧化酶的氨基酸序列具有显著差异性。在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。本专利技术的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本专利技术的单胺氧化酶。优选地，所述核酸是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的单胺氧化酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有单胺氧化酶活性的蛋白质；(c)与(a)的氨基酸序列具有至少95％同一性且具有单胺氧化酶活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种分离的单胺氧化酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基
衍生的具有单胺氧化酶活性的蛋白质；
(c)与(a)的氨基酸序列具有至少95％同一性且具有单胺氧化酶活性的蛋
白质。
2.编码权利要求1所述的单胺氧化酶的分离的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成的。
4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载
体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET28a。
7.包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。
8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌(E.coli)。
9.根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E.coliBL21(DE3)或E.coli
DH5α。
10.一种重组单胺氧化酶的制备方法，包括培养权利要求7-9任一项所述的重组
表达转化体，以及从培养物中获得重组单胺氧化酶。
11.一种催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物的催化剂，其选
自权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物
离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品；优选地，所述加工的制
品是由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的单胺氧化酶进行分离
和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的
分离产品而得到的固定化制品。
12.权利要求1所述的单胺氧化酶、权利要求10所述的方法制备的重组单胺氧化
酶或权利要求11所述的催化剂在催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成
手性加成产物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述前手性化合物为式I所示的化
合物：
其中，R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；，n选自0～5
的整数。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于所述前手性化合物在单胺氧化酶作
用下与氧化剂发生氧化反应，然后与MR发生加成反应生成式II所示的化合
物：
其中，
R1和R2独立地选自H、...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗煜，丁时澄，瞿旭东，钱龙，
申请(专利权)人：南京博优康远生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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