一种特异识别T-2毒素的寡核苷酸适配体制造技术

本发明专利技术提供了一种特异结合T-2毒素的小分子寡核苷酸适配体，该单链DNA适配体的序列为SEQ ID NO:1。通过基于氧化石墨烯分离的指数富集配体系统进化技术，体外筛选获得了高亲和力且特异识别T-2毒素的单链寡核苷酸适配体。该适配体具有广阔的应用前景，既可以用于分离富集样品中的痕量T-2毒素，也可以通过标记功能基团手段转化为报告适配体用于分析检测食品中的T-2毒素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种经SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备而得的高亲和力特异性结合T-2毒素的寡核苷酸适配体，为快速分离富集及分析检测T-2毒素奠定了基础。
技术介绍
T-2毒素(T-2toxin)是A类单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种，是一种倍半萜烯化合物。T-2毒素可由多种真菌产生，主要产自如三线镰刀菌、枝孢镰刀菌和梨孢镰刀菌等镰刀菌属，分布极广，严重危害人畜健康。T-2毒素毒性作用包括急性毒性作用、亚急性毒性、慢性毒性、三致作用、免疫毒性以及对血液系统和软组织的损害作用。T-2毒素的毒性较为稳定，室温放置6～7年或在100-120℃加热1h，其毒性依然不减。由于其毒性剧烈，国际上非常重视T-2毒素对人畜的危害，早在1973年，FAO/WHO就将单端孢霉烯族T-2毒素列为最危险的天然存在的食品污染源之一；“黄雨中毒”事件发生之后，关于T-2毒素的研究更为广泛和深入。目前，T-2毒素的测定方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、液相色谱质谱联用法(LC-MS)和酶联免疫法(ELISA)等免疫学检测法。TLC法虽然分析成本较低，但操作过程烦琐，重复性差。GC法和LC法都不能直接测定样品中的T-2毒素，通常需要衍生，GC法的衍生主要基于三甲硅烷基化作用和氟酰基化作用，LC法使用的衍生化试剂为氰酸蒽，在测定过程中使用了有毒化学试剂。LC-MS法灵敏度高，样品制备相对简便，不需要衍生化处理，但成本较高。依赖抗体的免疫学检测法操作简单、灵敏度高，适用于检测大量样品，无需大型昂贵仪器设备的优点，但假阳性率比较高，定量不够准确；且T-2作为一种分子量466g/mol的小分子半抗原，不具备免疫原性，需将其与大分子载体蛋白结合制备完全抗原后才能刺激动物分泌抗体，这个过程不仅繁琐耗时而且成本昂贵，且制得的抗体批次间稳定性不如寡核苷酸，抗体的储存条件也较寡核苷酸严苛。近些年来，寡核苷酸适配体作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配体是通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集的配体系统进化)技术筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。SELEX技术利用分子生物学技术，构建人工合成的随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度一般在20-40nt左右，两端引物序列一般在20nt左右，文库容量大约在1013-1015范围内。由于单链寡核苷酸随机序列，容易凸环、发卡、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、肽段、药物、氨基酸、有机化合物，甚至是金属离子相结合，形成很强结合力的复合体。至今报道的真菌毒素适配体，主要是通过将靶标固定在亲和层析柱或磁珠上进行SELEX筛选制备的，前者有赭曲霉毒素A，后者有伏马毒素B1，也有报道不同实验室分别用层析柱及磁珠筛选获得了玉米赤霉烯酮适配体。但目前尚无有关T-2毒素寡核苷酸适配体及其制备方法的研究报道。本专利技术以食品或饲料中常见的T-2毒素为靶标，利用基于氧化石墨烯(GO)分离的SELEX技术制备获得了与T-2毒素高亲和力特异性结合的寡核苷酸适配体。该寡核苷酸适配体可用于分离富集样品中的痕量T-2毒素，也可经特殊基团修饰后用于分析检测T-2毒素以丰富实验室检测手段，并可用于开发试纸条或便携式小型仪器以实现家庭、农田、工厂快速检测，因此该专利技术可以在真菌毒素检测领域得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能与T-2毒素特异性结合的寡核苷酸适配体，为开发T-2毒素的新型分离富集或分析检测工具奠定良好基础。本专利技术的另一目的是提供一种制备T-2毒素寡核苷酸适配体的方法，它可以方便、准确地获取T-2毒素的高亲和力单链DNA适配体，效果显著。本专利技术方法利用基于氧化石墨烯分离的SELEX技术，以T-2毒素为靶标，无需将小分子靶标固定在载体上，通过10轮的SELEX反复筛选后，对富集文库进行克隆测序，并分析代表序列的亲和力和特异性，最终获得与T-2毒素高亲和性特异结合的最佳寡核苷酸适配体。附图说明图1是全长序列Seq.2、Seq.6、Seq.16及截短序列Tc.2、Tc.6、Tc.16的模拟二级结构图。图2是Seq.2、Seq.6、Seq.16及Tc.6寡核苷酸适配体的饱和结合曲线图。图3是Seq.2、Seq.6及Seq.16寡核苷酸适配体的特异性试验结果。具体实施方式：以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例1：T-2毒素特异性结合寡核苷酸适配体的GO-SELEX筛选1、体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物(由美国Integrated DNA Technologies公司完成)，序列如下：5'-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-N40-GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'(40N代表40个随机核苷酸)；上游引物：5'-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3'下游引物：5'-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3'5′磷酸化下游引物：5'-P-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3'将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100μM贮存液存于-20℃备用。2、PCR扩增条件及Lambda核酸外切酶消化制备单链次库的条件将合成的随机单链文库(ssDNA)稀释作为PCR模板扩增出磷酸化的双链DNA(dsDNA)产物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次库的影响因素，最终确定制备单链次库的最佳条件。PCR反应体系为：稀释随机文库作为模板DNA1μL(100ng)，上游引物及磷酸化下游引物(20μM)各1μL，dNTPmix(each25mM)1μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，灭菌超纯水40μL，Taq酶1μL，总体积为50μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；循环20次；最后72℃延伸5min。通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增效果。将电泳条带位置正确且单一的PCR扩增产物用PCR产物纯化试剂盒(Generay Biotech.Co.,Ltd.)纯化，重溶于适当体积的灭菌超纯水中，通过Thermo NanoDrop2000超微量分光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异识别T‑2毒素的寡核苷酸适配体，其特征在于该寡核苷酸适配体的序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异识别T-2毒素的寡核苷酸适配体，其特征在于该寡核苷酸适配体的序列如
SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1中所述的寡核苷酸适配体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，陈秀娟，顾华杰，夏雨，吴世嘉，段诺，马小媛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32