本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及miR‑200b在制备Rac‑1蛋白表达抑制剂中的新用途。发明专利技术首先建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，进行相应组的miRNA激动剂或拮抗剂转染，分别过表达和低表达miR‑200b。结果显示转染miR‑200b后，Rac‑1蛋白表达降低，拮抗miR‑200b后，Rac‑1蛋白表达进一步升高，说明miR‑200b通过调节Rac‑1蛋白的表达参与缺氧缺血性脑损伤的修复作用。本发明专利技术提供了miR‑200b的新应用，可以有效的调节Rac‑1蛋白的表达，具有重要的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
m i R-200b在制备Rac-1蛋白表达抑制剂中的新用途
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种Rac-I蛋白抑制剂及其应用，更具体 的涉及一种miRNA及其应用。
技术介绍
microRNAs (miRNAs)是一种内源性非编码RNA，主要参与基因转录后水平的调控。 miRNAs通过与信使RNA(mRNAW非翻译区（UTR)结合导致靶mRNA降解或翻译抑制。与 其他小分子RNA不同，miRNA不需要严格的碱基配对，因此，可以广泛调节基因网络。虽 然miRNA的生物学功能刚刚被人们熟知，它在疾病发病和进展中所显现的治疗潜力已引起 人们极大的兴趣。越来越多的证据表明，以miRNA为基础的基因治疗，不管是增强或抑制 miRNA的表达和活性，都有很大的应用前景。 Rac-Ι 全称为 Ras 相关的 C3 肉毒毒素底物 I (ras-related C3 botulinum toxin substrate I)，属于Rho-GTP酶家族。Rac-I广泛表达，以两种构象状态存在，一种是失活的 ⑶P结合形式，另一种是活化的GTP结合形式。在细胞外信号的作用下，Racl通过鸟苷酸交 换因子（GEFs)转变成其活化形式。而GTP酶激活蛋白（GAPs)则使Rac-I失去活性。Rac-I 通过能协调多种信号传导级联反应的结构域与特异的效应物相互作用影响了多种生理作 用。Rac-I蛋白参与了许多细胞的多种生命活动，包括肌动蛋白细胞骨架的重构、细胞黏附、 细胞运动、上皮细胞的极性、胞浆移动、基因转录和表达以及细胞周期和凋亡的调控等。其 中较重要的是，Rac-I可通过参与Wnt/PCP通路，调节JNK的活性，从而发挥其重塑细胞骨架 等作用。Rac-I也可通过调控HIF-I α的表达和活性参与缺氧信号传导通路。Racl还可通 过JNK2激酶引起β -catenin在Serl91和Ser605的磷酸化，进而促进了 β -eatenin的核 转位，从而促进了经典的wnt信号传导通路。Rac-I蛋白参与了肿瘤发生、发展的各个阶段， 包括的肿瘤的生长和生殖、侵袭和转移、细胞周期进展、细胞凋亡以及肿瘤新生血管的生成 等。Rac-I分子功能的多样性与其上下游效应分子的多样性有关。 本专利技术旨在研究miR-200b在缺氧缺血性脑损伤的组织中与Rac-I的关系。专利技术 首先建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，进行相应组的miRNA激动剂或拮抗剂转染，分 别过表达和低表达miR-200b，于不同时间点取大鼠脑组织进行Western blot试验，检测 Rac-I蛋白的变化趋势，从而了解miR-200b对Rac-I的作用。结果显示转染miR-200b后， Rac-I蛋白表达降低，拮抗miR-200b后，Rac-I蛋白表达进一步升高，说明miR-200b可能通 过介导Wnt/PCP通路参与缺氧缺血性脑损伤的修复作用。本专利技术提供了 miR-200b的新应 用，可以有效的调节Rac-I蛋白的表达，这具有重要的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抑制Rac-I蛋白表达的方法，包括： 1)制备 miRNA-200b 模拟物； 2)将上步制备的miRNA转染到表达Rac-I蛋白的细胞或组织中。 所述 miRNA_200b 成熟序列为 mmu-mir-200b-3p (miRBase 登录号为 MIMAT0000233) 〇 进一步，所述 miRNA 选自 pri-miRNA、pre_miRNA、成熟 miRNA、dsmiRNA 及其片段或 变体中的一种或几种。 本专利技术中miRNA_200b、miR_200b、microRNA_200b属于同一物质的不同表达形式， 所代表的意思相同。 术语一miRNA Il (微小RNA)是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于，内源微小RNA 和人工微小RNA。内源miRNA是在基因组中天然存在的小RNAs，其能够调节mRNA的生产利 用。术语一人工的Il或一合成的Il miRNA包括除内源miRNA之外的任何类型的RNA序列， 其能够调节mRNA的生产利用。 一微小RNA侧翼序列Il是指包括miRNA加工元件的核苷酸序列。miRNA加工元件 是促成从前体miRNA产生成熟miRNA的最小限度核酸序列。称为pri-miRNAs的前体miRNA 在细胞核中被加工成大约15-70个核苷酸的pre-miRNAs，其折叠成不完全的莖-环结构。 miRNA模拟物（miRNA mimics)已经成为研究基因调控的工具之一。miRNA mimics 是一种RNA分子，可以通过载体导入细胞内，上调miRNA在细胞内或者活体内miRNA浓度， 从而调控基因表达。开发的miRNA mimics有两种，一种是如体分子60喊基以上的如体；一 种是双链的成熟体分子。这两种分子都已经证实，能够很好的上调miRNA在细胞内的丰度。 miRNA抑制剂（miRNA inhibitor)是运用化学方法合成的miRNA抑制剂，可通过与 成熟miRNA分子特异性结合而抑制miRNA作用，可以削弱细胞中内源性miRNA导致的基因 调控作用。 核酸递送系统包含所希望的核酸，例如但不限于，以作为一裸露Il核酸的一裸 露Il形式，或者配制在适合于递送的媒介物中，例如在具有阳离子分子或脂质体形成性脂 质的复合物中，或者作为载体的组分，或者作为药物组合物的组分。可以将核酸递送系统直 接地（例如通过使其与细胞相接触）或间接地（例如通过任何生物学过程的作用）提供 给细胞。例如但不限于，可以通过下列方式将核酸递送系统提供给细胞：胞吞作用，受体靶 向，与天然或合成细胞膜片段相偶联，物理手段例如电穿孔，使核酸递送系统与聚合物载体 例如控释薄膜或纳米颗粒或微颗粒相组合，使用载体，将核酸递送系统注射到围绕细胞的 组织或流体中，核酸递送系统简单扩散穿过细胞膜，或者通过任何主动或被动转运机制而 穿过细胞膜。另外，可以通过使用诸如病毒载体的与抗体相关的靶向和由抗体介导的固定 化的技术来将核酸递送系统提供给细胞。 进一步，将所述miRNA整合到载体中。 载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其他媒介物， 其已经通过插入或掺入用于产生微小RNA的核酸序列和可以附着至这些核酸序列的游离 核酸片段而进行了操作。病毒和逆转录病毒载体是优选的载体类型，并且包括但不限于 来自下列病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如：莫洛尼鼠白血病病毒；鼠干细胞病毒，哈维 (Harvey)鼠肉瘤病毒；鼠乳腺肿瘤病毒；劳斯肉瘤病毒；腺病毒；腺伴随病毒；SV40-型病 毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头状瘤病毒；疱疫病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒 例如任何逆转录病毒。本领域技术人员可以容易地采用本领域已知的其他载体。 载体优选质粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色体中的一种或几种。 miRNA可以合成获得，例如通过经由技术人员已知的任何合成方法来化学合成核 酸。然后，所合成的miRNA可以通过本领域已知的任何方法进行纯化。用于化学合成核酸的 方法包括但不限于，体外化学合成，其使用磷本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制Rac‑1蛋白表达的方法，包括：1)制备miRNA‑200b模拟物；2)将上步制备的miRNA施用到表达Rac‑1蛋白的细胞或组织中。
【技术特征摘要】
1. 一种抑制Rac-1蛋白表达的方法，包括： 1) 制备miRNA-200b模拟物； 2) 将上步制备的miRNA施用到表达Rac-Ι蛋白的细胞或组织中。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述miRNA选自pri-miRNA、pre-miRNA、 成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或变体中的一种或几种。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述miRNA整合到载体中。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的miRNA为经化学修饰的RNA。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆 固醇缀合物、环状葡聚糖复合物、聚乙烯亚胺聚合物或蛋白质复合物施用所述m...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔红，杨丽君，马东青，杨爱君，朱琳涵，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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