特异识别含有5-甲基化胞嘧啶的DNA的方法技术

本发明专利技术涉及特异识别含有5-甲基化胞嘧啶的DNA的方法。该方法包括用TALE蛋白来特异性识别DNA中的5-甲基化胞嘧啶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】特异识别含有5-甲基化胞嘧啶的DNA的方法
本专利技术涉及生物
，更具体地说，涉及特异识别含有5-甲基化胞嘧啶的DNA的方法。
技术介绍
TALE(TranscriptionActivatorLikeEffectors，转录激活子样效应因子)是植物致病菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的细胞内的一种蛋白质。当病原菌侵染植株时，病菌会通过其自身的III型分泌系统将包括TALE在内的一系列效应分子注入到植物细胞内。这些效应分子通过影响宿主细胞的信号传递，基因表达等方式来协助病菌进一步扩增。TALE则是这些效应分子中最大的一类，它像植物自身的转录激活子一样行使功能。TALE家族蛋白一般由3个主要的功能结构域组成，N端结构域与TALE的分泌转运有关；C端具有转录激活结构域和入核信号肽片段；位于TALE中部的区域是DNA结合结构域，但它的DNA结合结构域不同于其他已知的DNA结合结构域，它是由一段串联的重复单元组成，大多数情况下每个重复单元由34个氨基酸组成，个别重复单元由33或35个氨基酸残基组成。这34个氨基酸中除了第12和13位的氨基酸变化较大之外，其他氨基酸高度保守。这两个不保守的氨基酸被命名为RVD(repeatvariablediresidue，重复可变双残基)。J.Boch等人和M.J.Moscou等(参见J.Boch，H.Scholze，S.Schornack，A.Landgraf，S.Hahn，S.Kay，T.Lahaye，A.Nickstadt，U.Bonas，BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors，Science，326(2009)1509-1512和M.J.Moscou，A.J.Bogdanove，AsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectors，Science，326(2009)1501)已于2009年分别通过实验和生物信息学研究发现每个重复单元中第12和13位的氨基酸(RVD)与识别的核苷酸种类有特殊的对应关系，例如：表1部分RVD与DNA碱基序列的对应关系TALE蛋白的特异DNA序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景，科学家们可以设计组装任意的TALE单元去识别任意的DNA双螺旋序列。这一特性已经被用来构造切割特异双链DNA序列的DNA酶TALEN(TALEnuclease，TALE核酸酶)，用于在细胞基因组中引入定点突变、定点敲除等操作(A.J.Bogdanove，D.F.Voytas，TALeffectors：customizableproteinsforDNAtargeting，Science，333(2011)1843-1846.)。在目前所有已知的报道中，TALE识别的都是没有修饰的双链DNA。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及检测DNA中的胞嘧啶甲基化的方法，包括用TALE蛋白及其衍生蛋白来特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶。在优选实施方案中，采用两种不同的TALE蛋白，分别特异性识别靶标序列中的胞嘧啶和5-甲基化胞嘧啶。在进一步优选的实施方案中，所述方法用于检测CpG岛的甲基化。一方面，本专利技术涉及TALE蛋白及其衍生蛋白用于特异性识别DNA中的5-甲基化胞嘧啶的用途。另一方面，本专利技术涉及TALE蛋白及其衍生蛋白在制备用于特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶的试剂中的用途。另一方面，本专利技术涉及TALE蛋白及其衍生蛋白在制备用于诊断或治疗癌症的药物中的用途。在优选实施方案中，所述诊断或治疗是通过特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶来进行的。本专利技术另外涉及TALE蛋白及其衍生蛋白，其用于特异性识别5-甲基胞嘧啶修饰的DNA。本专利技术还涉及TALE蛋白及其衍生蛋白，其用于诊断或治疗癌症。TALE蛋白可以为自然界已有的TALE蛋白以及在此基础上通过基因方法突变、修饰、组装获得的保持或增强特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶的TALE衍生蛋白。所述TALE衍生蛋白还包含具有TALE蛋白DNA结合结构域的重组蛋白。附图说明图1是dHax3的DNA结合域(dHax3截短体，标记为dHax3-Δ)与双链DNA的高分辨率晶体结构(1.85埃)示意图。左图中的1-10表示dHax3的DNA结合域的每个重复单元，其识别右侧对应的DNA序列。每个重复单元由两个α螺旋组成，两个螺旋分别为a和b。该结构已上传到PDB数据库中，代码为：3V6T。其中dHax3(designedHax3)指经过改造的TALE蛋白Hax3。图2表示dHax3与DNA碱基间的相互作用。A、dHax3中RVD的侧链指向，RVD中的第一个氨基酸并没有伸向DNA大沟内部，同时第二个氨基酸将氨基酸侧链伸向DNA大沟；B、RVD中第一个氨基酸通过氢键稳定loop区域构象，当DNA结合结构域重复单元的第一位的氨基酸为天冬酰胺(N)或者组氨酸(H)时，它们与自身所在重复序列的第八位的氨基酸主链上的羰基氧原子形成氢键相互作用，起到稳定整个RVD所在loop构象的作用；C、RVD中第二个氨基酸与DNA碱基直接相互作用，当氨基酸残基为天冬氨酸(D)时，天冬氨酸的羧基氧会通过氢键与DNA中胞嘧啶的氨基直接形成氢键相互作用；当氨基酸残基为丝氨酸(S)时，丝氨酸中羟基与腺嘌呤中的N7形成直接氢键相互作用；当氨基酸残基为甘氨酸(G)时，它与胸腺嘧啶甲基之间会有范德华力相互作用，但是D、如A图所示的分子中，RVD为NG的loop构象；E、如B图所示的分子中，RVD为NG的loop构象。图3是胸腺嘧啶(左)与5-甲基胞嘧啶(右)结构比较图。从图中对比可以清楚的发现胸腺嘧啶(左)与5-甲基胞嘧啶(右)的唯一区别是六位上的氨基和羰基氧原子。而不论是氨基，还是羰基氧原子都可能通过范德华力与蛋白质的氨基酸残基相互作用。图4显示生化实验和晶体结构解析揭示了TALE蛋白通过NG识别5-甲基胞嘧啶。a、dHax3识别的含5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA序列(该序列称为dHax3-5mC，含有3个5mC，只显示dHax3的RVD所识别的碱基，具体序列详见实施例)以及dHax3蛋白中的相应的RVD；b、EMSA检测dHax3对不含5mC的DNA序列(称为dHax3box，其与dHax3-5mC序列相同，除了5mC为C)以及dHax3对含5mC的DNA序列(dHax3-5mC)的结合能力，每个泳道中加入大约4nM的核酸探针；同时泳道0～10的样品中加入了梯度浓度的dHax3蛋白，分别为浓度0，8nM，16nM，31.5nM，62.5nM，125nM，250nM，500nM，1000nM，2000nM，4000nM；c、dHax3的DNA结合域(dHax3-Δ)与含5mC的DNA序列(dHax3-5mC)的复合物晶体结构，显示侧链的碱基为5-甲基胞嘧啶，甘氨酸与5-甲基胞嘧啶形成范德华力相互作用，这种相互作用与甘氨酸与胸腺嘧啶。图5是电泳图，显示了dHax3全长蛋白的纯化结果。泳道标注说明：1.全菌破碎液；2.全菌破碎离心沉淀；3.全菌破碎离心上清液；4.镍柱培养弃液；5.镍柱清洗液；6.镍柱洗脱回收液；7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.04 CN 201210021039.21.TALE蛋白变体在制备用于检测DNA中的胞嘧啶甲基化的试剂中的用途，其中所述TALE蛋白变体选自：RVD为HD、NG或NN的TALE蛋白。2.权利要求1的用途，其中采用两种不同的TALE蛋白变体的重组蛋白，分别特异性识别靶标序列中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：施一公，颜宁，邓东，闫创业，潘孝敬，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11