一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法技术

一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂；2）细胞接种；3）卷烟烟气染毒；4）LDH测定；5）结果与分析。本发明专利技术通过烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液的制备，可分别考察烟气粒相物、气相物的细胞毒性，适于多种贴壁培养细胞，可用于考察卷烟烟气对不同细胞系的细胞毒性。通过细胞裂解液的选择、LDH基质液反应时间的优化提高检测灵敏度。并通过卷烟烟气染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。通过LDH的测定，可反映卷烟烟气粒相物和气相物对细胞膜的损伤程度，揭示卷烟烟气的细胞毒性机理。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：1）?配制实验试剂：?（1）LDH基质液的配制：用0.2?mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐?盐酸（Tris?HCl）缓冲液（pH8.2）配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为：乳酸锂5×10?2?mol/L、硝基氯化四氮唑（INT）?6.6×10?4?mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）?2.8×10?4?mol/L、氧化型辅酶Ⅰ（NAD）1.3×10?3?mol/L，LDH基质液应在临用前配制；（2）?细胞裂解液：?20%的曲拉通100（Triton?100）；（3）终止液：4M的盐酸（HCl）溶液；（4）细胞培养基：溶剂为RPMI?1640?培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L?谷氨酰胺的浓度为2?mM，青霉素的浓度为100?IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；（5）卷烟烟气染毒溶液；2）?细胞接种：所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞；向96孔板的每孔中加入100?μL细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96?孔板的最外周36?个孔中每孔加入100?μl?生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100?μl?细胞悬液，于37?℃、5%?CO2?条件下培养24?h；3）卷烟烟气染毒：使用细胞培养基将卷烟烟气染毒溶液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞接种24h后，吸去培养液，96?孔板（除最外周36?孔）每列6?孔为一组分别设置为正常对照组、7个不同剂量的烟气染毒组和LDH最大释放组，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100?μl的细胞培养基，烟气染毒组每孔加入100?μl不同浓度的烟气染毒溶液，96?孔板的最外周36?个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37?℃、5%?CO2?条件下培养24?h；4）LDH测定：染毒结束前15分钟，在LDH最大释放量孔中加入5μl裂解液，染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μlLDH基质液，反应一段时间后，加入50μl终止液，使用酶标仪检测每孔在490?nm?波长处的吸光值；5）结果与分析原始吸光值A?：A?=?A490?nm?A(染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值A(最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈欢，杨进，刘洋，刘彤，韩书磊，吴帅宾，付立伟，侯宏卫，胡清源，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：