【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种尼古丁的试纸条及其应用，可定性检测卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中的尼古丁。
技术介绍
1、
2、非法电子烟/类烟产品治理是一项具有创新性、挑战性的工作，任务艰巨复杂。这其中最主要的手段就是对此类产品中烟碱的筛查测定。而目前行业关于烟碱的测定方法几乎都是基于光度分析或色谱技术建立的，这些方法虽然具有结果准确、可靠性强的特点，但其分析周期长，技术要求高，只能在专业的实验室内完成。类烟产品中烟碱的现场、快速检测技术的匮乏，是行业全面有效的监管类烟产品的瓶颈所在。
技术实现思路
1、本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而一种能够检测卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中尼古丁含量的试纸条，并提供一种快速、简单、高效的适用于大批量样品的定性检测方法，适用于非法电子烟和类烟产品的现场稽查。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、一种检测尼古丁的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中：结合物释放垫上喷涂胶体金标记的尼古丁特异性抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有山羊抗小鼠二抗，尼古丁特异性抗体是以尼古丁半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原获得，所述尼古丁半抗原的制备方法如下：是由尼古丁和联硼酸频那醇酯在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化下进行硼化反应，制备5-四烷氧乙硼基-尼古丁(化合物3)，引入双氧水制备5-羟基-尼古丁(化合物4)，在
4、
5、所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或甲状腺蛋白。
6、所述尼古丁特异性抗体可为尼古丁单克隆抗体或尼古丁多克隆抗体，其中优选尼古丁单克隆抗体。
7、所述山羊抗小鼠二抗是将鼠源抗体免疫羊得到。
8、所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
9、所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
10、本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
11、1)制备喷涂有胶体金标记的尼古丁特异性抗体的结合物释放垫；
12、2)制备包被有尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有山羊抗小鼠二抗的质控线的反应膜。
13、3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
14、具体地说，步骤包括：
15、1)半抗原结构的优选：所述的本专利技术所采用的尼古丁半抗原是从8种尼古丁半抗原中优选而来，其筛选的原则以分子刚性结构和免疫学经验为依据，特别地对比了尼古丁5号位上不同取代基团的半抗原结构和动物免疫血清数据，同时考察了羧基半抗原和氨基半抗原的血清数据，实验结果表明5号位点的氨基半抗原免疫学结果较好，其中氨基半抗原-5(即尼古丁半抗原)为优选半抗原结构，见图3所示。
16、2)半抗原制备：是由尼古丁和联硼酸频那醇酯在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化下进行硼化反应，制备5-四烷氧乙硼基-尼古丁(化合物3)，引入双氧水制备5-羟基-尼古丁(化合物4)，在化合物4上引入叔丁基(2-溴乙基)氨基甲酸酯，最后加入三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和二氯甲烷(dichloromethane,dcm)制备尼古丁半抗原5-氨基-乙氧基-尼古丁(氨基半抗原-5)；具体反应过程及合成路线见图4所示。
17、3)将尼古丁半抗原与载体蛋白偶联，得到尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物；
18、4)用尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到尼古丁杂交瘤细胞株；
19、5)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到山羊抗小鼠二抗；
20、6)用氯金酸与柠檬酸三钠反应制备胶体金；
21、7)将步骤4)制备的尼古丁单克隆抗体加入步骤6)制备的胶体金中，得到胶体金标记的尼古丁单克隆抗体；
22、8)将胶体金标记的尼古丁单克隆抗体喷涂在结合物释放垫上，37℃烘12h后取出，置于干燥环境中保存备用；
23、9)将尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将山羊抗小鼠二抗包被在反应膜上构成质控线；
24、10)将样品吸收垫用含0.2％tween20、0.5％pvp k30、0.5％牛血清白蛋白、ph为7.4、0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干24h，置于干燥环境中保存备用；
25、11)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成4mm宽的小条，放入干燥剂，置于铝箔袋中密封，4～30℃条件下可保存12个月。
26、本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中尼古丁的方法，它包括步骤：
27、(1)将待测样本进行前处理，得到待测样本溶液；
28、(2)用试纸条进行检测；
29、(3)分析检测结果。
30、本专利技术的尼古丁快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及试纸条分析技术，将胶体金标记的尼古丁抗体固定于结合物释放垫上，样品中的尼古丁在流动过程中，与结合物释放垫上的胶体金标记的尼古丁单克隆抗体结合，形成尼古丁-抗体-胶体金标记物。样本中的尼古丁与反应膜检测线上的尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合胶体金标记的尼古丁单克隆抗体，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中尼古丁含量是否超过设定阈值。
31、检测结果的判断如图2所示。
32、阴性：检测线(t)显色比质控线(c)显色深或显色一致，表示样本中尼古丁含量浓度低于检测限，判为阴性。
33、阳性：检测线(t)显色比质控线(c)显色浅或检测线(t)不显色，表示样本中尼古丁浓度等于或高于检测限，判为阳性。
34、无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
35、本专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、储存简单、保质期长的优点。
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1.一种检测尼古丁的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其特征在于：结合物释放垫上喷涂胶体金标记的尼古丁特异性抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有山羊抗小鼠二抗，尼古丁特异性抗体是以尼古丁半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原获得，所述尼古丁半抗原的制备方法如下：是由尼古丁和联硼酸频那醇酯在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化下进行硼化反应，制备5-四烷氧乙硼基-尼古丁(化合物3)，引入双氧水制备5-羟基-尼古丁(化合物4)，在化合物4上引入叔丁基(2-溴乙基)氨基甲酸酯，最后加入三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)和二氯甲烷(Dichloromethane,DCM)制备尼古丁半抗原5-氨基-乙氧基-尼古丁(氨基半抗原-5)，其分子结构式为：
2.根据权利要求1所述的检测尼古丁的试纸条，其特征在于：制备尼古丁半抗原的具体反应过程即合成路径如下：
3.根据权利要求1所述的检测尼古丁的试纸条，其特征在于：所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述
4.根据权利要求1所述的检测尼古丁的试纸条，其特征在于：所述尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物是由尼古丁半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或甲状腺蛋白。
5.根据权利要求1所述的检测尼古丁的试纸条，其特征在于：所述山羊抗小鼠二抗是将鼠源抗体免疫羊得到。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述试纸条的方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.一种应用权利要求1-5任一项所述试纸条检测卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟和类烟产品中尼古丁含量的方法，其特征在于：具体步骤包括：
...【技术特征摘要】
1.一种检测尼古丁的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其特征在于：结合物释放垫上喷涂胶体金标记的尼古丁特异性抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有尼古丁半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有山羊抗小鼠二抗，尼古丁特异性抗体是以尼古丁半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原获得，所述尼古丁半抗原的制备方法如下：是由尼古丁和联硼酸频那醇酯在甲氧基(环辛二烯)合铱二聚体催化下进行硼化反应，制备5-四烷氧乙硼基-尼古丁(化合物3)，引入双氧水制备5-羟基-尼古丁(化合物4)，在化合物4上引入叔丁基(2-溴乙基)氨基甲酸酯，最后加入三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和二氯甲烷(dichloromethane,dcm)制备尼古丁半抗原5-氨基-乙氧基-尼古丁(氨基半抗原-5)，其分子结构式为：
2.根据权利要求1所述的检测尼古丁的试纸条，...
【专利技术属性】
技术研发人员：范子彦，唐纲岭，王颖，彭云铁，孙莹莹，师默闻，刘珊珊，边照阳，杨飞，邓惠敏，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：
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