本发明专利技术公开了一种重组的人源Ang‑2在制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物中的用途。发明专利技术人发现，重组的人源Ang‑2保护猪髂骨动脉内皮细胞免于人源抗体介导的补体依赖型细胞毒性，因此重组的人源Ang‑2可以作为制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物的重要活性成分。
The 2 recombinant human Ang use in preparation of Medicine
The invention discloses a drug use of a recombinant human Ang 2 in preparation to protect porcine endothelial cells from human antibody mediated complement dependent cytotoxicity. The inventors have found that human Ang recombinant 2 protect porcine iliac artery endothelial cells from complement mediated antibody dependent cytotoxicity, an important active component of the drug so recombinant human Ang 2 can be used as preparation to protect porcine endothelial cells from human antibody mediated complement dependent cytotoxicity.
【技术实现步骤摘要】
重组的人源Ang-2在制备药物中的用途
本专利技术涉及细胞因子的用途
，尤其涉及重组的人源Ang-2在制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物中的用途。
技术介绍
人类器官供体的缺乏是器官移植的最主要的限制之一。猪器官被认为是解决这个问题的最适宜的供体来源。可是，在猪器官移植到灵长类动物中，凝血调节紊乱和炎症反应仍然是一个问题。血管内皮细胞，这类细胞与人类免疫细胞的相互作用在异种移植中具有重要的作用。内皮细胞损伤和功能性失调在炎症与凝血反应的发展中具有重要的影响因素，并且在灵长类动物或者人类受体中，能够影响后来猪异种移植后的存活时间。在血清中，异源抗体，例如，Gal抗体和Neu5Gc抗体，能够诱导由抗体介导的依赖于补体的细胞毒性，进而导致内皮细胞的损伤。在炎症反应中，细胞因子起重要的作用。在以前的报道中发现人源IL-4和IL-13，而不是IL-11，TGF-β2或者IL-10，保护猪内皮细胞防止通过激活的PI3K/AKT信号途径而进行的人类抗体介导的补体依赖型细胞毒性(CDC)。可是，这些细胞因子抑制或者促进内皮细胞毒性，是否是通过人类抗体介导的补体依赖型细胞毒性，人们仍然是不清楚的。在血管发育中血管生成素具有重要的作用并且它们可以稳定其整体性。血管生成素1(Ang-1)是一种对内皮血管特异性受体酪氨酸激酶2的特异配体，这个激酶在血管成熟和血管重塑中具有重要的意义。Ang-1/Tie2途径能够增强血管的整体性和通过激活PI3K/AKT信号途径的从而促进内皮细胞的存活时间。Ang-2与Ang1共用Tie2受体，在与Ang1共通作用下，同样的被认为在血管增长和血管重塑过程具有重要的作用。对于Tie2，Ang-1被认为是一种激动剂，而Ang-2被认为是拮抗剂，起相反的作用。
技术实现思路
专利技术人研究发现，Ang-1和Ang-2保护猪内皮细胞防止通过激活的PI3K/AKT信号途径而进行的人类抗体介导的补体依赖型细胞毒性。Ang-1和Ang-2不能改变IgM或者IgG对于PIECs的结合，以及在Ang-1和Ang-2处理下不能上调表达PIECs补体调节因子(CD46、CD55和CD59)。基于以上发现，本专利技术提供一种重组的人源Ang-2在制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物中的用途。进一步地，上述猪内皮细胞是猪髂骨动脉内皮细胞。进一步地，上述重组的人源Ang-2是通过腺病毒介导表达的人源Ang-2。进一步地，上述腺病毒介导表达的过程中，通过实时定量PCR和/或半定量PCR检测人源Ang-2的mRNA的表达水平。进一步地，上述实时定量PCR和/或半定量PCR所使用的用于检测人源Ang-2的引物对是：5’-agaaccagacggctgtgatg-3’(SEQIDNO：3)和5’-gaagttcaagtctcgtggtct-3’(SEQIDNO：4)。进一步地，上述实时定量PCR和/或半定量PCR以GAPDH作为内参，用于检测上述内参的引物对是：5’-acagacagccgtgtgttcc-3’(SEQIDNO:5)和5’-accttcaccatcgtgtctca-3’(SEQIDNO:6)。进一步地，上述重组的人源Ang-2通过激活PI3K/AKT通路来保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性。基于本专利技术的发现，Ang-1和Ang-2保护PIECs免于人源抗体介导的CDC，因此Ang-1和Ang-2可以作为制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物的重要活性成分。附图说明图1显示Ang-1和Ang-2诱导保护PIECs免于人源抗体介导的CDC。(A)PIECs用重组人EGF(100ng/ml)、bFGF(50ng/ml)、VEGF165(100ng/ml)、IL-33(40ng/ml)、IL-17(100ng/ml)、Ang-1(500ng/ml)、IL-4(20ng/ml)或作为阴性对照(NC)的培养基培养48小时，然后暴露于人血清以诱导抗体介导的CDC。(B)PIECs用不同浓度的rhAng-1(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml)或作为NC的培养基处理48小时，然后暴露于人血清诱导抗体介导的CDC。(C)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)或培养基作为NC处理0、24小时、48小时或72小时，然后暴露于人血清以诱导抗体介导的CDC。(D-E)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)或作为NC的培养基处理0、24小时、48小时或72小时，然后暴露于人血清诱导抗体介导的CDC。通过CCK8(D)或中性红(E)评价细胞毒性的程度。(F)PIEC用不同浓度的rhAng-2(200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)或作为NC的培养基处理48小时，然后暴露于人血清诱导抗体介导的CDC。(G)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)、rhAng-1加rhAng-2或作为NC的培养基处理48小时，然后暴露于人血清诱导抗体介导的CDC。数据代表至少三个独立实验(平均值±SEM)。通过Student'st检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图2显示利用腺病毒系统在PIECs中异位表达Ang-1和Ang-2保护PIECs免于人源抗体介导的CDC。(A)使用腺病毒系统构建人Ang-1或Ang-2基因。包装腺病毒。PIECs用ADV-Ang-1，ADV-Ang-2或ADV-EV(空载体)感染72小时，然后暴露于人血清诱导抗体介导的CDC。(B-C)PIECs用ADV-Ang-1(B)，ADV-Ang-2(C)或ADV-EV感染72小时。收集总RNA用于RT-PCR分析。用人Ang-1引物(B)或Ang-2引物(C)评估mRNA水平，并标准化至猪GAPDH。(D)如(B-C)中所述收集RNA，并使用人Ang-1、Ang-2或猪GAPDH引物通过半定量PCR评估mRNA水平(N.D.＝未测定)。数据代表至少三个独立实验(平均值±SEM)。通过Student'st检验，***p<0.001。图3显示在PIEC中，rhAng-1或rhAng-2不上调CD46、CD55或CD59的表达。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)(A)或rhAng-2(500ng/ml)(B)处理0、2h、6h或12h。通过RT-PCR检测CD46、CD55或CD59的mRNA水平。数据代表至少三个独立实验(平均值±SEM)。图4显示人IgG或IgM与PIECs的结合程度不受rhAng-1或rhAng-2影响。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)或作为NC的培养基处理48小时，然后与热灭活的人血清温育30分钟。通过流式细胞术(A)检测人IgM和IgG与PIEC的结合。通过几何平均荧光强度(Gmean)(B)评价人IgM或IgG与PIEC的结合程度。数据代表至少三个独立实验(平均值±SEM)。通过Student'st检验，*p&本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组的人源Ang‑2在制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物中的用途。
【技术特征摘要】
1.重组的人源Ang-2在制备保护猪内皮细胞免于人抗体介导的补体依赖型细胞毒性的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述猪内皮细胞是猪髂骨动脉内皮细胞。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组的人源Ang-2是通过腺病毒介导表达的人源Ang-2。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述腺病毒介导表达的过程中，通过实时定量PCR和/或半定量PCR检测人源Ang-2的mRNA的表达水平。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述实时定量PCR和/或半定量PCR所使用的用于检测人源Ang-2的引物对是：5’-agaacca...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟丽莎，蔡志明，高汉超，陈鹏飞，韦玲，刘璐，徐佳，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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