一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法技术

一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法，包括以下步骤：1）口含烟浸提物的制备；2）细胞接种培养；3）口含烟浸提物染毒；4）CCK‑8染色试验；5）结果与分析。本发明专利技术的特点在于：首次建立了口含烟的体外细胞毒性测试，且在进行测试时，减少了多次洗涤细胞的步骤，使得实验过程更加简便；CCK‑8试剂可在染毒后直接加入细胞培养基，无需换液步骤，产生的水溶性甲臜产物可直接进行吸光值检测，减少了检测前的溶解步骤，缩短了实验周期和时间；且可实现连续多次的吸光值检测，无需增加额外的实验步骤，为寻找合适的检测时间点提供了方便；CCK‑8试剂本身对细胞毒性小，避免了本底的影响和实验误差，测试结果重复性好、稳定性强、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及口含烟的体外毒理学评价研究领域，具体说是一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法。
技术介绍
口含烟是一种通过非燃烧途径进行烟草消费的新型烟草制品。其不需要燃烧，有害成分明显降低，并且不会产生“环境烟草烟气”。消费口含烟是许多国家的传统。然而，研究报告表明，口含烟也可以导致人体健康的不良影响，可以引起口腔、消化道以及其他人体部位癌变，可致瘾，有可能是导致心脑血管疾病的危险因素。实际上口含烟种类颇多，不同种类间成分和致癌能力差异巨大。根据现有资料，口含烟中已知致癌物或潜在致癌物有28种，包括烟草特有亚硝胺、多环芳烃、重金属等。有关口含烟健康影响的报道主要基于流行病学数据和单一化合物的实验室动物实验研究结果，而对于口含烟的体外毒性测试的文献报道很少，还没有统一标准的体外毒性测试方法。口含烟有不同类型，如含化型、袋装型等。不同类型的口含烟进行体外毒性测试时需要采用相应的提取方法对口含烟进行样品浸提，获得可进行体外毒性试验的口含烟浸提物。CCK-8是一种广泛用于细胞增殖和细胞存活率测试的快速、简便、高灵敏度检测试剂，在电子耦合试剂存在的情况下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲瓒产物。甲瓒产物的数量与活细胞的数量成正比，颜色越深，细胞存活率越高。口含烟毒性较低，在进行体外细胞毒性评价时，需要灵敏度高的测试方法；同时在进行批量样品的毒性检测时也要求试验方法快速、简便。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对上述存在的问题，建立了针对不同类型口含烟的浸提物提取方法；并基于CCK-8试剂颜色反应的原理，根据口含烟不同浸提物毒性的特点，建立的一种口含烟浸提物体外细胞毒性测定方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法，包括以下步骤：（1）口含烟浸提物的制备：分别将口含烟样品处理后用二甲基亚砜（DMSO）或去离子水进行浸提，于37 ℃震荡24±3 h后，1800 g离心30-60 min，吸取上清转移至新离心管中，25000 g离心30-60 min，吸取上清经无菌过滤器过滤后-80℃保存，即可获得口含烟样品的DMSO浸提物或水溶性浸提物储存液；两次离心的意义在于：第一次离心是去除口含烟样品的基质物质，第二次离心的离心力大大增大，其目的是将粗提液中的化学成分与不溶性杂质充分的分离，进而获得浸提充分的口含烟浸提物，以免粗提液中的杂质干扰细胞毒性的测试结果。（2）细胞接种培养：经扩增培养的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）或人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）进行消化以后，制备细胞悬液(1×105个/mL)，将细胞接种至96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；（3）口含烟浸提物染毒：使用细胞培养基将口含烟样品浸提物储存液调整到不同浓度，设置5个非零浓度。细胞培养24 h后，吸去培养基，96孔板(除最外周36孔)每孔加入100 μL的含有阴性对照、样品浸提物或阳性对照的细胞培养基，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μL细胞培养基作为空白对照，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；空白对照：细胞培养基，孔内无细胞；阴性对照：口含烟DMSO浸提物染毒试验的阴性对照为含有与最高剂量组的DMSO浓度一样的DMSO细胞培养基；口含烟水溶性浸提物染毒试验的阴性对照为细胞培养基。阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），浓度100-200 μg/mL；（4）CCK-8染色试验：（5）结果与分析：样品浸提物孔吸光值：At阴性对照孔吸光值：Ac空白对照组吸光值：Ab细胞存活率C（%）=×100%公式中的分母表示的是平均值：吸光值的平均值。所述口含烟样品为含化型口含烟样品或袋装型口含烟样品；当口含烟样品为含化型口含烟样品时，处理时先将其切碎并进行称重，再用二甲基亚砜或去离子水浸提。根据称重的数据确定浸提溶剂的体积量，进而得到合适浓度的浸提液当口含烟样品为袋装型口含烟样品时，取其内容物干重，再用二甲基亚砜或去离子水浸提。本专利技术的内容是建立口含烟浸提物的制备和体外细胞毒性测定方法。本专利技术可以制备针对不同类型口含烟的水溶性和更剧烈的有机溶剂浸提物，根据实验的目的不同测试不同浸提物的毒性。在进行细胞毒性测试时，减少了多次洗涤细胞的步骤，使得实验过程更加简便；CCK-8试剂可在染毒后直接加入细胞培养基，无需换液步骤，产生的水溶性甲臜产物可直接进行吸光值检测，减少了检测前的溶解步骤，缩短了实验周期，节省了时间更加快速；且可实现连续多次的吸光值检测，无需增加额外的实验步骤，为寻找合适的检测时间点提供了方便；CCK-8试剂本身对细胞毒性小，避免了本底的影响和实验误差，测试结果重复性好、稳定性强、灵敏度高。本专利技术是针对口含烟与卷烟和电子烟的不同而专门设计的，卷烟产生的烟气需要进行滤片捕集后提取进行毒性测试，电子烟的毒性测试可直接将电子烟烟液用来染毒细胞，而口含烟在进行毒性测试时，需要先对其进行所含成分的提取即样品前处理浸提。同时，不同的浸提方式对于毒性的测试目的和测试结果影响非常大，本专利技术建立了温和方式的水溶性浸提方法和更剧烈的有机溶剂浸提方法（DMSO），两种方法所获得的提取液的化学成分不同，因此毒性测试结果也不同，使用者可根据实验目的选择相应的浸提方法。CCK-8是一种广泛用于细胞增殖和细胞存活率测试的检测试剂，在本专利技术中作为口含烟提取物的细胞毒性测试的检测试剂，方便易得、简便快速、灵敏度高。本专利技术建立的是口含烟体外细胞毒性测试的一套完整的实验方法，从样品提取物的多种方式制备，到细胞毒性的快速检测，是样品前处理浸提方法的创新和与快速毒性检测的方法组合的创新。附图说明图1为实施例1口含烟DMSO浸提物染毒CHO细胞毒性测试图。图2为实施例1口含烟水溶性浸提物染毒CHO细胞毒性测试图。图3为实施例2口含烟DMSO浸提物染毒BEAS-2B细胞毒性测试图。图4为实施例2口含烟水溶性浸提物染毒BEAS-2B细胞毒性测试图。从结果中可看出，口含烟样品的水溶性浸提物的染毒剂量高于DMSO浸提物，在高浓度染毒剂量下引起细胞的存活率降低。口含烟的水溶性浸提物和DMSO浸提物均具有体外细胞毒性，DMSO浸提物的毒性效应大于水溶性提取物，可能与口含烟所含的化学成分组成不同有关。具体实施方式本专利技术以下结合实施例附图做进一步说明：具体实施一选取去离子水和二甲基亚砜（DMSO）分别对某市售含化型口含烟样品进行萃取获得水溶性浸提物和DMSO浸提物。采用CCK-8试验检测浸提液对中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）存活率的影响。CHO细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，于37℃、5% CO2条件下培养24 h后，进行染毒24 h。水溶性浸提物染毒剂量分别为：0（阴性对照）、2500、5000、10000、20000和40000 μg/mL；DMSO浸提物染毒剂量分别为：0（阴性对照）、250、500、1000、2000、和4000 μg/mL。染毒24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，细胞于37 ℃、5% CO2条件下孵育约3 h，使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光值。测试结果参见图1、图2。具体实施二选取去离子水和二甲基亚砜（DMSO）分别对某市本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）口含烟浸提物的制备：分别将口含烟样品处理后用二甲基亚砜（DMSO）或去离子水进行浸提，于37 ℃震荡24±3 h后，1800 g离心30‑60 min，吸取上清转移至新离心管中，25000 g离心30‑60 min，吸取上清经无菌过滤器过滤后‑80℃保存，即可获得口含烟样品的DMSO浸提物或水溶性浸提物储存液；细胞接种培养：经扩增培养的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）或人支气管上皮细胞（BEAS‑2B细胞）进行消化以后，制备细胞悬液1×105个/mL，将细胞接种至96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；口含烟浸提物染毒：使用细胞培养基将口含烟样品浸提物储存液调整到不同浓度，设置5个非零浓度；细胞培养24 h后，吸去培养基，96孔板除最外周36孔之外每孔加入100 μL的含有阴性对照、样品浸提物或阳性对照的细胞培养基，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μL细胞培养基作为空白对照，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；空白对照：细胞培养基，孔内无细胞；阴性对照：口含烟DMSO浸提物染毒试验的阴性对照为含有与最高剂量组的DMSO浓度一样的DMSO细胞培养基；口含烟水溶性浸提物染毒试验的阴性对照为细胞培养基；阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），浓度100‑200 μg/mL；CCK‑8染色试验：结果与分析：样品浸提物孔吸光值：At阴性对照孔吸光值：Ac空白对照组吸光值：Ab细胞存活率C（%）=×100%公式中的分母表示的是平均值：吸光值的平均值。...

【技术特征摘要】
1.一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）口含烟浸提物的制备：分别将口含烟样品处理后用二甲基亚砜（DMSO）或去离子水进行浸提，于37 ℃震荡24±3 h后，1800 g离心30-60 min，吸取上清转移至新离心管中，25000 g离心30-60 min，吸取上清经无菌过滤器过滤后-80℃保存，即可获得口含烟样品的DMSO浸提物或水溶性浸提物储存液；细胞接种培养：经扩增培养的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）或人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）进行消化以后，制备细胞悬液1×105个/mL，将细胞接种至96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；口含烟浸提物染毒：使用细胞培养基将口含烟样品浸提物储存液调整到不同浓度，设置5个非零浓度；细胞培养24 h后，吸去培养基，96孔板除最外周36孔之外每孔加入100 μL的含有阴性对照、样品浸提物或阳性对照的细胞培养基，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μL细胞培养基作为空白对照，于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李翔，赵俊伟，尚平平，乔梁峻，华辰风，谢复炜，刘惠民，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41