一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物医用高分子材料领域，公开了一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。本发明专利技术载体材料结构如通式(1)所示：

Non viral gene transfection carrier material with low cytotoxicity and high transfection efficiency, preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of biomedical polymer materials, and discloses a non viral gene transfection carrier material with low cytotoxicity and high transfection efficiency, as well as a preparation method and an application thereof. The carrier material structure of the present invention is shown in general formula (1):

【技术实现步骤摘要】
一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医用高分子材料领域，特别涉及一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。
技术介绍
近二十年来，基因疗法是被认为是一种治疗肿瘤和多种免疫疾病的有效方法。它是将正常基因或具有修复作用的质粒(pDNA)通过一定的方式导入靶细胞来纠正基因缺陷，从而达到治疗目的；或者是通过特定方式将具有沉默功能的小干扰RNA(siRNA)导入靶细胞来沉默致病基因的表达，从而达到治疗的目的。要达到这样的目标，必需将外源基因负载到合适载体上，然后将基因递送至靶细胞，载体起到保护基因的目的，否则其将被核酸酶降解，以至于导致基因治疗失败。因此，对能够负载并保护基因的载体材料的选择，就变得非常关键。病毒具有携带基因转染细胞的天然生物功能，因此可以高效率的将外源基因导入到靶细胞，效率非常高。常用的病毒载体主要有腺病毒，逆转录病毒和慢病毒等，虽然转染效率高，但病毒载体的致命缺陷是能够引发免疫响应而导致患者死亡(N.S.Templeton,BioscienceReports,2002,22,283-295)。此外，病毒也具有不能够大批量制备、成本高、运载基因容量有限等缺点(D.Ibraheem,A.Elaissari,H.Fessi,InternationalJournalofPharmaceutics,2014,459:70–83)。针对此缺点，研究者根据基因自身带负电的结构特点，使带阳离子的化合物与基因通过静电吸引作用来形成纳米尺度的复合物胶束，从而保护基因，安全性比病毒载体大大增加。非病毒载体主要有阳离子脂质体、阳离子聚合物以及阳离子无机化合物等。阳离子脂质体的应用最为广泛，但阳离子脂质体为小分子物质，带正电荷较少，与基因结合能力不够强，转染效率也不高。更为关键的是，脂质体每个分子带正电荷数少，因此完全中和基因的负电荷时的投料量就很大，这大大增加了脂质体类载体的细胞毒性。事实上，载体的安全性一直是困扰基因疗法的瓶颈，例如，1999年，一例患肝病的18岁病人JesseGelsinger在使用基因疗法的过程中死亡，这次事件导致全球基因疗法的临床试验基本停止(N.S.Templeton,BioscienceReports,2002,22,283-295)，这是基因疗法发展历史上的重大挫折。病人死亡的原因是腺病毒载体(AV)使病人的免疫系统过度反应，引发患者多器官衰竭和脑死亡。尽管基因治疗一直在曲折中前进，今年的麻省理工学院技术评论仍将基因治疗技术评为“2017年十大技术突破”之一(E.Mulin,MITtechnologyreview,2017,March/April)，这直接得益于2012年以来更为安全的腺相关病毒载体(AAV)的使用。尽管如此，病毒载体由于自身本性的限制，安全性仍是无法避免的问题。由此看来，开发更为安全、低细胞毒性以及高转染效率的新型非病毒类聚合物载体，无疑仍旧是解决基因疗法瓶颈的关键。
技术实现思路
为了克服上述现有技术非病毒载体的细胞毒性的缺点与不足并保证转染的高效性，本专利技术的首要目的在于提供一种基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料。本专利技术的载体材料为侧链含有伯胺离子的多肽类载体，可有效地和siRNA结合形成纳米复合物胶束，可向靶细胞中传递siRNA，细胞毒性低，甚至无细胞毒性；转染效率好，可与经典的高效率转染载体聚乙烯亚胺(PEI)相媲美。本专利技术另一目的在于提供一种上述非病毒基因转染载体材料的制备方法。本专利技术再一目的在于提供上述非病毒基因转染载体材料在siRNA递送中的应用。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料，其结构如通式(1)所示：其中，R1可以为苄基、烷基或聚乙二醇，n为聚合度，x为侧链不含双键的重复单元的聚合度，且x<n。本专利技术的载体材料为侧链含有伯胺离子的多肽类载体，可有效地和siRNA结合形成纳米复合物胶束，可向靶细胞中传递siRNA，细胞毒性低，甚至无细胞毒性；转染效率好，可与经典的高效率转染载体聚乙烯亚胺(PEI)相媲美。一种上述基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，包括四步合成反应：(1)L-半胱氨酸与溴丙炔的亲核取代反应制备S-炔丙基-L-半胱胺酸；(2)制备S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体；(3)引发S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)；(4)通过光化学点击技术将聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)侧链改性，制备水溶性的阳离子多肽。上述制备方法具体包括以下四个步骤：(1)L-半胱氨酸与溴丙炔发生取代反应，生成侧链含有C≡C键的S-炔丙基-L-半胱氨酸；(2)步骤(1)得到的S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气在乙酸乙酯中发生闭环反应，生成S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐；(3)利用端基为伯氨基的引发剂引发步骤(2)的S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到侧链含C≡C键的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)；(4)利用“巯基-炔”光化学点击技术，将半胱胺盐酸盐接枝到步骤(3)的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)的侧链，得到阳离子多肽。具体地，步骤(1)的过程和产物结构如下式(一)所示。其中溴丙炔与L-半胱氨酸的摩尔比优选为1:1.1～1:2.0；反应时间优选为2～3h。上述反应优选在冰浴条件下进行，具体为向溶有L-半胱氨酸的氨水溶液中滴加溴丙炔进行反应；氨水的浓度优选为3.0～4.0M；。产物用水和乙醇混合溶剂重结晶两次。步骤(2)的过程和产物结构如下式(二)所示。其中，S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气的反应摩尔比例为3:1；所述反应温度控制在80～90℃，优选为80～85℃；反应时间为3～6h，优选为4～6h。上述反应优选在回流状态下进行。反应后，将含有产物的乙酸乙酯溶液用冰冷的0.5％碳酸氢钠水溶液萃取以除掉副产物HCl，无水硫酸钠吸干燥，过滤后旋蒸干有机溶液，得到白色的固体物S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐。步骤(3)的过程和产物结构如下式(三)所示。所选用的引发剂可以是苄胺、丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、端基为伯氨基的聚乙二醇中的至少一种。所述聚合温度控制在0～25℃，优选为0～5℃；聚合时间优选为36～72h。所述聚合的反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，产物在乙醚或甲醇中沉淀，真空干燥得到浅红褐色产物聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)。步骤(4)的过程和产物结构如下式(四)所示。所述多肽侧链的炔基和半胱胺盐酸盐的巯基的摩尔比为1:2～1:4，优选为1:2.5～1:3。具体为将步骤(3)中的多肽和半胱胺盐酸盐分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中，混合后加入光引发剂安息香双甲醚，在紫外光的照射下反应。紫外光的最大吸收波长为365nm，光强为4mW·cm-2，功率为4W，光照时间为10～30min。引发剂用量占所有反应物总质量的5％。本专利技术的基于聚(L-半胱氨酸)主链的阳离子多肽，可以用做非病毒基因递送载体，能有效地和siRNA结合形成纳米复合物胶束，可向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料，其特征在于其结构如通式(1)所示：

【技术特征摘要】
1.一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料，其特征在于其结构如通式(1)所示：其中，R1为苄基、烷基或聚乙二醇，n为聚合度，x为侧链不含双键的重复单元的聚合度，且x<n。2.一种权利要求1所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于包括四步合成反应：(1)L-半胱氨酸与溴丙炔的亲核取代反应制备S-炔丙基-L-半胱胺酸；(2)制备S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体；(3)引发S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)；(4)通过光化学点击技术将聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)侧链改性，制备水溶性的阳离子多肽。3.根据权利要求2所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于具体包括以下四个步骤：(1)L-半胱氨酸与溴丙炔发生取代反应，生成侧链含有C≡C键的S-炔丙基-L-半胱氨酸；(2)步骤(1)得到的S-炔丙基-L-半胱氨酸和三光气在乙酸乙酯中发生闭环反应，生成S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐；(3)利用端基为伯氨基的引发剂引发步骤(2)的S-炔丙基-L-半胱氨酸-N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到侧链含C≡C键的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)；(4)利用“巯基-炔”光化学点击技术，将半胱胺盐酸盐接枝到步骤(3)的多肽聚(S-炔丙基-L-半胱胺酸)的侧链，得到阳离子多肽。4.根据权利要求3所述的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉刚，易玲，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44