一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种DHAV‑3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，用于鸭甲肝病毒3型(DHAV‑3)抗体的快速检测。本发明专利技术所述鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA检测试剂盒，以合成的多肽W7为包被抗原，其对于DHAV‑3抗体的特异性高，安全性好，且不含无关杂蛋白，只与DHAV‑3阳性血清特异结合，不与其它病毒的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，使得本发明专利技术所述检测试剂盒具有很高的特异性和敏感性。 1

DHAV-3 type peptide indirect ELISA antibody detection kit and its application

The invention belongs to the field of biological engineering technology, in particular to a DHAV peptide 3 type polypeptide indirect ELISA antibody detection kit, which is used for rapid detection of the antibody of duck hepatitis A virus type 3 (DHAV 3). The inventive duck hepatitis A virus type 3 polypeptide indirect ELISA detection kit, the synthesized polypeptide W7 is a clad antigen, which has high specificity, good safety and no irrelevant clutter for DHAV 3 antibody, and is only specifically combined with the positive serum of DHAV 3, and is not cross reacting with the positive serum of other viruses. The antigenicity of the detection kit has high specificity and sensitivity. One

【技术实现步骤摘要】
一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，用于鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)抗体的快速检测。
技术介绍
鸭病毒性肝炎是危害雏鸭的一种急性、高致死性传染病，具有发病急、病程短、传播快、病死率高等特点，主要侵害3周龄以内雏鸭，严重威胁养鸭业健康发展。该病的病原为鸭甲型肝炎病毒(DuckhepatitisAvirus，DHAV)，由于DHAV序列之间存在显著差异，且不同型的DHAV间无交叉反应，又将DHAV分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。迄今为止，国内流行的主要为DHAV-1和DHAV-3毒株，除台湾外，内陆尚未见DHAV-2毒株的报道。流行病学研究结果显示，近年来DHAV-3的感染有明显增加趋势，其危害越来越严重。随着DHAV-3疫苗的问世，如何评价该疫苗的免疫效果已迫在眉睫。目前DHAV抗体的检测主要依赖传统的血清中和试验，但该方法存在检测周期长，费时费力的缺陷，不利于批量样品的快速检测；并且基于全病毒建立的ELISA方法因DHAV纯化比较困难而限制了该方法的推广应用。VP1基因编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，是决定病毒抗原性的主要成分。利用基因工程技术研制的针对DHAV-3的ELISA抗体检测试剂盒已有报道，但该试剂盒是选用完整的VP1蛋白作为包被抗原，该蛋白表面存在较多的抗原表位，可能或多或少存在非特异性干扰现象。而合成的特异性抗原表位多肽其抗原特异性高，是最理想的ELISA检测抗体的包被抗原，可实现DHAV-3抗体的高通量检测，为鸭甲肝病毒3型的综合防控提供技术支撑。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，以实现鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)抗体的快速检测。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，包括以DHAV-3型合成多肽W7包被的ELISA板；所述合成多肽W7包括如N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH所示的氨基酸序列结构。所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，所述合成多肽W7的氨基酸序列结构为N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH。所述合成多肽W7包被的ELISA板的制备方法为：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作包被液，将所述合成多肽W7稀释至浓度为1μg/mL，按100μL/孔剂量加入至ELISA反应板中，于37℃下作用2小时，并于4℃包被过夜，拍干后用PorcineskinGelatin于37℃封闭2小时，以pH7.4、含浓度0.05％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干并待其干燥后装入含干燥剂的包装袋保存，备用。所述试剂盒还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒：所述样品稀释液为含浓度0.05％吐温-20的0.01M的磷酸盐缓冲液，pH7.4；所述10×浓缩洗液为含浓度0.5％吐温-20的0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.4；所述酶结合物工作液为HRP-羊抗鸭IgG；所述显色液为体积比1：1的浓度0.2mg/mL四甲基联苯胺(TMB)溶液和含浓度0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液的混合液；所述终止液为浓度0.31％氢氟酸溶液；所述阳性对照为经筛选获得的DHAV-3阳性血清，其OD650nm≥1.0，并加入1000U/mL的青链霉素；所述阴性对照为经筛选获得的阴性血清，其OD650nm≤0.25，并加入1000U/mL的青链霉素。本专利技术还公开了所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，包括将待检血清加入至所述合成多肽W7包被的ELISA板的步骤。所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，具体包括：将待检血清用所述样品稀释液按1：100比例进行稀释，随后按100μL/孔剂量加入至所述ELISA板中，同时设阴性对照及阳性对照，于37℃孵育45min；反应结束后，弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3-5次，每次间隔1min，拍干；随后每孔加100μL所述酶结合物工作液，于37℃孵育45min；随后加洗涤液洗涤3-5次，每次间隔1min，拍干；并依次加入100μL显色液，于37℃避光孵育15min，并加50μL终止液终止反应，用酶标仪在650nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。本专利技术还公开了所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒在DHAV-3抗体的检测领域中的应用。本专利技术还公开了一种快速检测DHAV-3抗体的方法，包括以所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒对待测血清进行检测的步骤；其检测样本的判定标准为：当待检样本OD650nm值与阴性对照OD650nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD650nm值大于0.280判为阳性。本专利技术所述鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA检测试剂盒，以合成的多肽W7为包被抗原，其对于DHAV-3抗体的特异性高，安全性好，且不含无关杂蛋白，只与DHAV-3阳性血清特异结合，不与其它病毒的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，使得本专利技术所述检测试剂盒具有很高的特异性和敏感性。本专利技术所述鸭甲肝病毒3型多肽间接ELISA检测试剂盒，可对DHAV-3抗体水平作出评价，该试剂盒操作简便、快速，适合批量样品的检测，大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。具体实施方式实施例1合成多肽W7的特异性验证本实施例所述合成多肽W7的氨基酸序列结构为N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH，其合成可以按照本领域技术人员所熟知的多肽合成的方法进行，如多肽的固相合成等方法予以合成。将合成的多肽W7用碳酸盐缓冲液分别稀释至蛋白浓度为1μg/mL，每孔100μL包被，放湿盒37℃作用1h后4℃过夜，弃去液体，以PBST洗涤3次，拍干；随后加入封闭液PorcineskinGelatin，控制剂量300μL/孔，于37℃封闭2h；弃去液体，加PBST洗涤3次；用样品稀释液将鸡阳性血清(DHAV-3)和SPF鸡阴性血清分别作1：100稀释，控制剂量100μL/孔，于37℃作用1h；弃去液体，以PBST洗涤3次；加入羊抗鸡的二抗，控制剂量100μL/孔，37℃作用30min；弃去液体，PBST洗涤3次；加底物(TMB)，控制剂量100μL/孔，避光作用15min；加入终止液，控制剂量50μL/孔，放酶标仪读数。表1多肽的特异性验证上表1所示结果表明，所述合成多肽W7只能与DHAV-3阳性血清发生特异性反应，而与DHAV-1无交叉反应。实施例2试剂盒成分配制所述样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液：取KH2PO40.2g，NaHPO4·12H2O2.9g，NaCl8g，定容至1000mL，再加0.5mL吐温-20；所述10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1MpH7.4磷酸盐缓冲液：取KH2PO42g，NaH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DHAV‑3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括以DHAV‑3型合成多

【技术特征摘要】
1.一种DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括以DHAV-3型合成多肽W7包被的ELISA板；所述合成多肽W7包括如N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH所示的氨基酸序列结构。2.根据权利要求1所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述合成多肽W7的氨基酸序列结构为N-SRNHRPFRFCLRLKT-CooH。3.根据权利要求1或2所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述合成多肽W7包被的ELISA板的制备方法为：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作包被液，将所述合成多肽W7稀释至浓度为1μg/mL，按100μL/孔剂量加入至ELISA反应板中，于37℃下作用2小时，并于4℃包被过夜，拍干后用PorcineskinGelatin于37℃封闭2小时，以pH7.4、含浓度0.05％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干并待其干燥后装入含干燥剂的包装袋保存，备用。4.根据权利要求1-3任一项所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：6.根据权利要求4或5所述的DHAV-3型多肽间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含浓度0.05％吐温-20的0.01M的磷酸盐缓冲液，pH7.4；所述10×浓缩洗液为含浓度0.5％吐温-20的0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.4；所述酶结合物工作液为HRP-羊抗鸭IgG；所述显色液为体积比1：1的浓度0.2mg/mL四甲基联苯胺(TMB)溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：马秀丽，于可响，王锐，刘存霞，胡峰，郭效珍，刘玉山，史玉颖，宋敏训，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，山东天牧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37