牛乳铁蛋白间接竞争酶联免疫检测试剂盒制造技术

一种牛乳铁蛋白间接竞争酶联免疫检测试剂盒，主要包括包被有牛乳铁蛋白抗原的酶标板、系列浓度的bLF标准品、兔抗bLF多克隆抗体、辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体、单组份TMB显色液、浓缩洗涤液和终止液。所有溶液成分装塑料瓶，放置于刻有孔位的泡沫垫上。利用本试剂盒可在1小时内定量检测牛乳或者乳制品中的牛乳铁蛋白含量，快速、方便，非常适合基层实验室批量检测使用。

【技术实现步骤摘要】
牛乳铁蛋白间接竞争酶联免疫检测试剂盒
本技术属于免疫检测
，涉及一种牛乳铁蛋白间接竞争酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
乳铁蛋白(lactoferrin，简写为LF)是一种存在于乳汁中的活性蛋白，其不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具潜力的食品和饲料添加剂，国家食品安全标准GB14880也将其列为营养强化剂。目前市场上常见的乳铁蛋白主要是从牛乳中提取的牛乳铁蛋白(bovinelactoferrin，简写为bLF)，然后将其添加至配方乳粉、营养健康食品及膳食补充机、免疫调节保健品等，乳铁蛋白的含量已经成为这些相关产品质量的主要指标。常见的检测乳铁蛋白的方法由液相色谱法、毛细管电泳法、双抗体夹心法等，其中前两种方法检测需要依赖大型仪器设备，价格昂贵且操作复杂，而双抗体夹心法则由于双特异性抗体与bLF形成夹心复合物，而使得检测信号放大，最终使得检测灵敏度太高。牛乳样本在实际检测时往往需要稀释到数百倍以上才能使得含量处于检测曲线范围，从而导致操作误差放大，检测准确度降低。因此亟需检测灵敏度始终，并且能够快速检测的方法来检测相关产品中的bLF。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种检测牛乳及乳粉中牛乳铁蛋白的间接竞争酶联免疫检测试剂盒，主要包括如下组成部分：(1)包被有bLF抗原的酶标板；(2)系列浓度的bLF标准品6瓶；(3)兔抗bLF多克隆抗体；(4)辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体；(5)单组份TMB显色液；(6)浓缩洗涤液；(7)终止液；以上所有主要组分放置在刻好位置的泡沫托上，并与产品操作说明书、质控报告等一起包装于盒体中，形成完整的检测试剂盒。所述的盒体长方形盒体。所述的包被有bLF抗原的酶标板为96孔酶标板，可拆卸成为12条8微孔的独立酶标板条，方便用户根据检测样本数量选取。所述的系列浓度的bLF标准品包括0ppm，0.1ppm，0.3ppm，0.9ppm，2.7ppm，8.1ppm共计6个不同浓度梯度，体积均为1.5mL，分别盛放于2mL棕色瓶。所述的兔抗bLF多克隆抗体是含有防腐剂的兔抗体，体积为7mL，是用bLF标准品免疫新西兰兔后采集血清纯化获得，盛放于10mL塑料瓶。所述的辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体，是采购的商品化抗体，体积为7mL，盛放于10mL棕色瓶。所述的单组份TMB显色液，为商品化底物，体积为10mL，盛放于10mL棕色瓶。所述的浓缩洗涤液，体积为60mL，盛放于60mL塑料瓶；所述的终止液，体积为7mL，盛放于10mL棕色瓶。此外，为了实验操作方便，试剂盒中还提供了带有编号的酶标板盖板膜，可用于盖板和酶标微孔编号。与传统仪器方法和国家标准方法相比较，本技术突出优点在于：1、检测方便、速度快、操作简便，适合于大量样本的同时筛选检测。96孔酶标板按照双孔对照操作，最多可以同时检测42份样本。2、检测成本低廉，单个样本检测成本不超过50元，是仪器检测方法的十分之一，甚至更少，可以给检测单位节省大量成本。3、灵敏度适中，特别适合于奶粉、牛奶等产品的快速检测，尤其适用于基层实验室和乳品厂等场合检测应用，有助于从生产一线控制乳品质量。附图说明图1为本技术试剂盒盒体。图2为本技术试剂盒泡沫托垫及孔位示意图。图3为酶标板示意图。图4为试剂瓶示意图。图5为试剂盒标准曲线。附图标记：1、盒体；2、试剂盒泡沫托垫；3、bLF标准品(3-1～3-6，共计6个)孔位；4、兔抗bLF多克隆抗体孔位；5、辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体孔位；6、单组份TMB显色液孔位；7、终止液孔位；8、浓缩洗涤液孔位。具体实施方式实施例1：乳铁蛋白兔多克隆抗体的制备及纯化将购买的牛乳铁蛋白标准品(sigma，L9507)以0.01MPBS(pH7.2～pH7.4)稀释至1mg/mL，以每千克体重0.5mg的剂量与等量的弗氏佐剂混合乳化免疫新西兰大耳兔。首次免疫采用弗氏完全佐剂，后续免疫采用弗氏不完全佐剂，免疫方式为皮下多点注射，免疫间隔为2周，第三次免疫后10天耳缘静脉采血，测定效价。继续加强免疫，第5次免疫后10天采集分离血清。以饱和硫酸铵沉淀获得粗纯的兔IgG，参考文献操作如下：(1)取兔血清5mL与等量的PBS混合，然后逐滴加入2倍体积的饱和硫酸铵溶液(pH7.0)，使硫酸铵的终浓度为50％饱和度，边加入边搅拌；(2)充分混匀后4℃静置过夜，然后在4℃10000r/min离心30min，弃去上清；(3)沉淀用10mLPBS溶解，继续逐滴加入饱和硫酸铵5mL，使硫酸铵终浓度为33％饱和度，边加入边搅拌，充分混匀后离心，弃去上清；(4)重复步骤(3)3～4次，将最后获得的沉淀用适量的PBS溶解后，用100倍体积的PBS置于4℃透析48h，期间换液4～5次。将透析完毕的粗纯抗体继续以ProteinG亲和层析纯化，具体操作参考亲和柱操作说明书进行，此处不再赘述。亲和纯化获得高纯度的兔抗牛bLF多克隆抗体即可直接用于ELISA检测，也可以置于-20℃或者-80℃长期保存。实施例2：抗原包被板的制备将牛乳铁蛋白标准品用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，然后以100μL每孔加入酶标板，4℃孵育过夜，然后甩出孔中液体，PBST(含有0.05％吐温-20的PBS)洗板3次，以1％马血清200μL每孔，37℃封闭2h，然后甩干孔中液体，PBST洗板3次，拍干，继续置于0.1MPa干燥，与干燥剂一起真空封装后，置于2～8℃保存。实施例3：试剂盒各溶液组分的制备分别按照如下方式准备试剂盒溶液组分：(1)系列标准品：将牛乳铁蛋白标准品用PBS稀释至0ppm，0.1ppm，0.3ppm，0.9ppm，2.7ppm，8.1pp，然后分装在棕色瓶中保存，2～8℃保存备用。(2)兔抗bLF多抗：将前期制备兔多克隆抗体以PBS稀释至1:10000，加入终浓度为0.03％叠氮纳，然后以0.22μm滤器过滤除菌，然后以7mL的体积无菌分装在塑料瓶中，2～8℃保存备用。(3)HRP标记羊抗兔二抗：将购买的商品化二抗用PBS稀释至1:5000，继续加入终浓度为0.03％的Proclin300，然后以0.22μm滤器过滤除菌，以7mL的体积无菌分装在塑料瓶中，2～8℃保存备用。(4)单组份TMB显色液：直接分装为7mL，无菌分装，2～8℃保存备用。(5)终止液：2M硫酸直接分装7mL，无菌分装备用。(6)浓缩洗涤液：称取NaCl,212.5g；Na2HPO4·12H2O,72g；NaH2PO47.4g；Tween-20，50mL,定容至1L去离子水中，加终浓度为0.01％Proclin300，然后以0.22μm滤器过滤除菌，无菌分装。60mL/瓶，2～8℃保存。实施例4：试剂盒的组装将bLF标准品6瓶(3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6)、兔抗bLF多克隆抗体1瓶(4)、辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体1瓶(5)、单组份TMB显色液1瓶(6)、终止液(7)1瓶、浓缩洗涤液1瓶(8)放置于试剂盒的泡沫托垫(2)相应孔位孔，放入试剂盒盒体(1)中；将96孔可拆卸酶标板包被bLF抗原后，装入铝箔袋，并加入干燥剂，抽真空，放入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛乳铁蛋白间接竞争酶联免疫检测试剂盒，主要包括包被有牛乳铁蛋白抗原的酶标板、系列浓度的bLF标准品6瓶(3‑1、3‑2、3‑3、3‑4、3‑5、3‑6)、兔抗bLF多克隆抗体(4)、辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体(5)、单组份TMB显色液(6)、终止液(7)、浓缩洗涤液(8)，分别放置在泡沫托垫(2)上的刻好的孔位，然后与说明书、质控报告包装在盒体(1)中形成完整的试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种牛乳铁蛋白间接竞争酶联免疫检测试剂盒，主要包括包被有牛乳铁蛋白抗原的酶标板、系列浓度的bLF标准品6瓶(3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6)、兔抗bLF多克隆抗体(4)、辣根过氧化物标记的羊抗兔抗抗体(5)、单组份TMB显色液(6)、终止液(7)、浓缩洗涤液(8)，分别放置在泡沫托垫(2)上的刻好的孔位，然后与说明书、质控报告包装在盒体(1)中形成完整的试剂盒。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板为96...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春江，莫勋，吴迪，袁志波，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：新型
国别省市：北京,11