涉及突变型艰难梭菌毒素的组合物和方法技术

一方面，本发明专利技术涉及包含突变型艰难梭菌毒素A和/或突变型艰难梭菌毒素B的免疫原性组合物。突变型毒素可包括相对于对应野生型艰难梭菌毒素具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。突变型毒素可包括被化学交联的至少一个氨基酸。另一方面，本发明专利技术涉及用于培养艰难梭菌和制备艰难梭菌毒素的方法和组合物。

Compositions and methods involving mutant Clostridium difficile toxin

On the one hand, the invention relates to immunogenic compositions containing mutant Clostridium difficile toxin A and / or mutant Clostridium difficile toxin B. The mutant toxin can include the domain of the glucosyl transferase structure with at least one mutation corresponding to the toxin of the wild type of Clostridium difficile and the domain of the cysteine protease with at least one mutation. Mutant toxins may include at least one amino acid that is chemically cross-linked. On the other hand, the invention relates to methods and compositions for cultivating Clostridium difficile and preparing Clostridium difficile toxin.

【技术实现步骤摘要】
涉及突变型艰难梭菌毒素的组合物和方法本申请是申请日为2013年10月7日的第201380054635.3号专利技术名称为“涉及突变型艰难梭菌毒素的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2012年10月21日提交的美国临时申请61/716,605的权益，其整体援引加入本申请。
本申请涉及与突变型艰难梭菌相关的毒素的组合物和方法。
技术介绍
艰难梭菌(C.difficile)是与人胃肠道疾病相关的革兰氏阳性厌氧菌。如果天然肠道细菌群落经由抗生素治疗后减少，艰难梭菌的建群通常出现在结肠。通过分泌作为艰难梭菌主要毒力因子的糖基化毒素，毒素A和毒素B(分别为308和270kDa)，感染能导致与抗生素相关的腹泻和有时假膜性结肠炎。毒素A和毒素B分别由基因tcdA和tcdB编码于19kb致病性座位(PaLoc)内。艰难梭菌的非致病性菌株的此座位被另一115个碱基对的序列所替代。毒素A和毒素B均为强力细胞毒素。这些蛋白为灭活Rho/Rac/Ras家族小GTP酶的同源性葡萄糖基转移酶。所导致的信号传导的中断引起细胞-细胞连接的缺失、肌动蛋白细胞骨架的失调和/或细胞凋亡，由此导致与艰难梭菌感染(CDI)相关的深处的分泌性腹泻(profoundsecretorydiarrhe)。在近十年，艰难梭菌在医院、疗养院和其它长期护理机构中爆发的数量和严重程度显著增加。这种逐步增长的关键因素包括强毒病原菌的出现、抗生素使用的增加、检测方法的改进和在健康护理机构中更多的暴露于空气传播的孢子。对于与艰难梭菌相关疾病(CDAD)的抗生素治疗，甲硝达唑和万古霉素代表目前接受的护理标准。然而，在第一次CDI事件后大约20％接受此治疗的患者经历感染的复发，那些患者中的多至大约50％经受另外的复发。复发的治疗极具挑战，大部分复发通常在前面的事件的一个月内发生。因此，需要涉及艰难梭菌的免疫原性和/或治疗性组合物及其方法。
技术实现思路
本文提供本专利技术的这些和其它目标。一方面，本专利技术涉及突变型艰难梭菌毒素A。突变型毒素A包括与野生型毒素A相比在285、287、700、972和978位残基处的突变。在一个实施方式中，突变型毒素A包括SEQIDNO:183。在一个实施方式中，突变型毒素A比对应的野生型毒素A的细胞毒性更低。在一个实施方式中，突变型细胞毒素A包括经化学修饰的至少一个氨基酸残基。一方面，本专利技术涉及分离的多肽，其包括SEQIDNO:183。另一方面，本专利技术涉及突变型艰难梭菌毒素B。突变型毒素B包括与野生型毒素B相比在286、288、698、970和976位残基处的突变。在一个实施方式中，突变型毒素B包括SEQIDNO:184。在一个实施方式中，突变型毒素B比对应的野生型毒素B的细胞毒性更低。在一个实施方式中，突变型细胞毒素A包括经化学修饰的至少一个氨基酸残基。一方面，本专利技术涉及分离的多肽，其包括SEQIDNO:184。本专利技术还涉及用于培养艰难梭菌和制备艰难梭菌毒素的组合物和方法。一方面，本专利技术涉及包括植物水解物和艰难梭菌细胞的培养基。在一优选实施方式中，水解物为大豆水解物。更优选地，大豆水解物为大豆水解物SE50MK。另一方面，本专利技术涉及包括氮源和艰难梭菌细胞的培养基。在一个实施方式中，氮源为酵母提取物。优选地，酵母提取物为HYYEST412(KerryBiosciences)。另一方面，本专利技术涉及包括植物水解物、酵母提取物和艰难梭菌细胞的培养基。在一个实施方式中，培养基不包含碳源。在一优选实施方式中，培养基进一步包括碳源。专利技术人发现与不含碳源的发酵相比，艰难梭菌在包含至少一种碳源的培养基中的发酵产生高OD600值和高毒素生产率。在一个实施方式中，碳源为葡萄糖、甘露醇、果糖和/或甘露糖。在一个实施方式中，艰难梭菌细胞未被遗传修饰。在一个实施方式中，艰难梭菌细胞为重组艰难梭菌细胞。在一个实施方式中，艰难梭菌缺少编码毒素的内源性多核苷酸。在另一个实施方式中，细胞包括组成型启动子。在一优选实施方式中，启动子为生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)铁氧还蛋白(fdx)启动子。在另一实施方式中，细胞不包含天然的、调节型染色体启动子。在另一方面，本专利技术涉及培养艰难梭菌的方法。所述方法包括在培养基中培养艰难梭菌细胞。在一个实施方式中，培养基包含大豆水解物和/或酵母提取物。在一优选实施方式中，培养基进一步包括碳源。优选地，碳源为葡萄糖。在一个实施方式中，培养步骤在厌氧条件下进行。在一个实施方式中，艰难梭菌作为种子培养物生长。在一个实施方式中，种子培养物通过从在培养物中生长的原种培养物(stockculture)接种来起始。在一个实施方式中，艰难梭菌作为发酵培养物生长。在一个实施方式中，发酵培养物从在培养基中生长的种子培养物接种。在另一方面，本专利技术涉及培养艰难梭菌的方法。所述方法包括在单克隆抗体培养基中培养艰难梭菌细胞。一方面，本专利技术涉及制备艰难梭菌毒素的方法。所述方法包括在培养基中培养艰难梭菌细胞。所述方法进一步包括从所述培养基中分离艰难梭菌毒素。附图说明图1A-H：使用CLUSTALW比对(缺省参数)，来自630、VPI10463、R20291、CD196株的野生型艰难梭菌毒素A和具有SEQIDNO:4的突变型毒素A的序列比对。图2A-F：使用CLUSTALW比对(缺省参数)，来自630、VPI10463、R20291、CD196株的野生型艰难梭菌毒素B和具有SEQIDNO:6的突变型毒素B的序列比对。图3：图表显示野生型毒素阴性艰难梭菌株的鉴定。对于毒素A，通过ELISA测试13种艰难梭菌株的培养基。如图所示，7种菌株表达毒素A，6种菌株不表达(1351、3232、7322、5036、4811和VPI11186株)毒素A。图4A和图4B：SDS-PAGE结果表明，在使用UDP-14C-葡萄糖的体外糖基化测试中，三重突变体A(SEQIDNO:4)、双重突变体B(SEQIDNO:5)和三重突变体B(SEQIDNO:6)并不糖基化Rac1或RhoAGTP酶；然而，10μg至1ng野生型毒素B糖基化Rac1。图5：免疫印迹表明，相比于对野生型毒素A和B(分别为SEQIDNO:1和2)的切割片段的观察，突变型毒素A和B(分别为SEQIDNO:4和6)中半胱氨酸蛋白酶活性消失。参见实施例13。图6：图表显示，通过IMR-90细胞中体外细胞毒性测试，当在高浓度(如约100μg/ml)下测定时，三重突变型毒素A和B(分别为SEQIDNO:4和6)显示剩余细胞毒性。图7：图表显示对于三重突变型毒素B(SEQIDNO:6)和七重突变型毒素B(SEQIDNO:8)，EC50值类似。图8：图表代表来自体外细胞毒性测试的结果，其中ATP水平(RLU)针对三重突变型TcdA(SEQIDNO:4)(上幅图)和三重突变型TcdB(SEQIDNO:6)(下幅图)的浓度增加绘制。通过特异于突变型毒素A(上幅图-pAbA和mAbsA3-25:A60-22)和突变型毒素B(下幅图-pAbB)的中和抗体，突变型毒素A和B的剩余细胞毒性可被完全消除。图9：处理后72小时的IMR-90细胞形态学的图像。图A显示假(mock)处理的对照细胞。图B显示经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备突变型艰难梭菌毒素的方法，包括在适合条件下在培养基中培养源自VPI 11186的重组艰难梭菌以产生毒素，并从所述培养基中分离所述毒素；其中所述培养基包含大豆水解物、酵母提取物和葡萄糖，且其中所述细菌缺少编码毒素的内源性多核苷酸，其中所述细菌包括编码突变型艰难梭菌毒素的多核苷酸，其中所述细菌进一步包括生孢梭菌铁氧还蛋白(fdx)启动子。

【技术特征摘要】
2012.10.21 US 61/716,6051.一种制备突变型艰难梭菌毒素的方法，包括在适合条件下在培养基中培养源自VPI11186的重组艰难梭菌以产生毒素，并从所述培养基中分离所述毒素；其中所述培养基包含大豆水解物、酵母提取物和葡萄糖，且其中所述细菌缺少编码毒素的内源性多核苷酸，其中所述细菌包括编码突变型艰难梭菌毒素的多核苷酸，其中所述细菌进一步包括生孢梭菌铁氧还蛋白(fdx)启动子。2.权利要求1的方法，其中所述培养基进一步包含聚乙二醇2000。3.权利要求1的方法，其中所述培养基进一步包含甲砜氯霉素。4.权利要求1的方法，其中所述细菌包括编码突变型艰难梭菌毒素的多核苷酸，其中所述细菌进一步包括生孢梭菌铁氧还蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·U·扬森，A·S·安德森，R·G·K·唐纳德，M·J·弗林特，N·K·卡利安，J·A·洛特温，M·K·希胡，J·K·莫兰，M·E·鲁彭，W·孙，
申请(专利权)人：辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国,US