提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。所述工艺将重组毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5M L‑赖氨酸或L‑精氨酸。本发明专利技术能有效防止目的产物被蛋白酶降解，使用的氨基酸分子量小，后续提取易除去，而且成本比酪蛋白水解物低，为规模化生产减少损失，带来实际应用价值。

Fermentation process to improve the stability of recombinant human collagen

The invention discloses a fermentation process for improving the stability of recombinant human collagen. The recombinant Pichia pastoris was inoculated into the sterilized fermentation medium by adding glycerol flow plus methanol flow and inducing the expression stage. After the methanol induction of 84h, 0.2 ~ 0.5M L lysine or L arginine was added to the fermentation tank. The invention can effectively prevent the degradation of the target product by protease, small molecular weight of amino acids used, easy removal of subsequent extraction, lower cost than casein hydrolysate, reduced loss for large-scale production, and practical application value.

【技术实现步骤摘要】
提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺
本专利技术属于生物发酵
，涉及一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。
技术介绍
目前，食品、化妆品、医疗领域的胶原蛋白，大多来自动物如猪、牛、鱼等动物皮肤、骨骼等组织。这类原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理得到，但是上述方法得到的胶原蛋白成分复杂，批差异性大，存在病毒隐患，如疯牛病毒携带隐患，屠宰过程的环境控制、交叉污染的局限性，动物与人体的异源性导致需要增加去除免疫原性，影响了胶原蛋白在医药方面的应用。随着DNA重组技术的迅速发展，各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。中国专利201110327865.5构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为136小时，蛋白表达量为16g/L，但在发酵末期，产物浓度批次有不增长或者被降低至3g/L，为实际生产造成了人力、能源、财物等重大损失，为后续提取带来较多困难。因此，在发酵末期，稳定产物不被蛋白酶降解，至关重要。毕赤酵母发酵手册上提到，用1％酪蛋白水解物酸(casaminoacids)可以减少目的蛋白被降解。但是，酪蛋白水解物酸市场价格约3300元/kg，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种降低生产成本的提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。该工艺通过在甲醇诱导阶段中加入L-赖氨酸(L-Lys)或L-精氨酸(L-Arg)，有效防止目的产物重组人源胶原蛋白被蛋白酶降解。本专利技术的技术方案如下：提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，一次性向发酵罐添加0.2～0.5ML-Lys或0.2～0.5ML-Arg。本专利技术所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。本专利技术所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O0.3～1.175g/L，K2SO44.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O3.7～14.9g/L，KOH1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。本专利技术的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.2～5.4，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术在发酵过程中，通过在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.2-0.5ML-Lys或0.2-0.5ML-Arg，使得大罐发酵产物重组人源胶原蛋白稳定保留90％以上。同时L-Lys市场价格约240元/kg，L-Arg约70元/kg，明显降低了生产用的氨基酸成本，减少企业人力、物力的损失，稳定供货，为企业产生巨大的经济价值。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详述。实施例1发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO426.7mL/L；CaSO4·2H2O1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O14.9g/L；KOH4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM14.35mL/L。将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.2ML-Arg，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.6g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.76g/L，保留了95.2％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.18g/L，保留了86.3％。实施例2发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO426.7mL/L；CaSO4·2H2O1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O14.9g/L；KOH4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM14.35mL/L。将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.5ML-Lys，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.8g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.3g/L，保留了97％。模拟后续提取一批耗时，再需要放置10h，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.3g/L，保留了91％。实施例3发酵培养基为基础盐培养基(BSM，参考CN102443057B)：85％H3PO426.7mL/L；CaSO4·2H2O1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O14.9g/L；KOH4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM14.35mL/L。将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.3。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，在甲醇诱导发酵84h时，一次性向发酵罐添加0.5ML-Arg，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平连续2次增加小于1mg/ml后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.8g/L，为模拟1T罐分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为17.4g/L，保留了98％。模拟后续提取一批耗本文档来自技高网...

【技术保护点】
提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，一次性向发酵罐添加0.2～0.5M L‑赖氨酸或0.2～0.5M L‑精氨酸。

【技术特征摘要】
1.提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，一次性向发酵罐添加0.2～0.5ML-赖氨酸或0.2～0.5ML-精氨酸。2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为CGMCCNo.5021。3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的毕赤酵母发酵培养基配方...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯丽萍，黄建民，赵健烽，杜尔凤，陶海，季乐，
申请(专利权)人：江苏江山聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32