通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺。所述工艺先将表达重组胶原蛋白的毕赤酵母菌接种于灭菌的发酵培养基，在发酵初期种液培养阶段下调磷酸初始浓度，同时在甲醇诱导表达阶段采取磷酸定量连续流加的方式。本发明专利技术通过调节初始培养基中的磷酸浓度以及甲醇诱导表达阶段磷酸的添加方式，调节毕赤酵母菌的生长代谢，提高重组胶原蛋白合成速率，发酵水平最高提升了29.929％，发酵时间相应可缩短16～32h。发酵时间相应可缩短16～32h。

【技术实现步骤摘要】
通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺


[0001]本专利技术属于生物发酵
，涉及一种通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺。

技术介绍

[0002]磷是微生物发酵培养基中的重要营养来源，对菌体生长和产物的合成有很大影响。细胞中主要含磷的组分是DNA、RNA和polyPi等多聚化合物，主要以正磷酸盐(Pi)、焦磷酸(PPi)或聚磷酸(polyPi)等无机磷形式和核酸、磷酸糖、磷酸化蛋白和磷脂等有机磷形式存在于胞内。微生物可利用磷源物质进行细胞代谢的调控。例如，当培养基中Pi源足量时，微生物由多聚磷酸激酶(PPK)大量生成poly Pi。当Pi源不足时，PPK酶可以polyPi为底物、逆向反应生成ATP、GTP等含高能磷酸键物质。
[0003]磷在碳源代谢和能量代谢过程中扮演核心角色，其原因是许多酶反应需要以磷酸盐为底物，反应所需的关键酶活性受到磷浓度的调控，如磷酸果糖激酶、3
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磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶。同时，由底物磷酸化获得的自由能将贮存在由ADP和Pi合成的ATP中。此外，许多重要的细胞调控机制依靠磷元素，例如在双组分信号转导系统和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷酸转移反应中。综上，微生物发酵过程中，发酵液中的磷含量会对产物产生影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺。该工艺通过降低发酵培养基中磷酸的初始浓度，以及在产物表达阶段采取恒速流加磷酸的方式，调节毕赤酵母生长代谢速度，提高重组胶原蛋白表达量和生产水平。
[0005]实现本专利技术的技术方案如下：
[0006]通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺，包括以下步骤：
[0007]将表达重组胶原蛋白的毕赤酵母菌种液接种到灭菌的低磷酸浓度的发酵培养基中，基础培养12～16小时后，开始流加50％甘油至目标菌体湿重，甘油流加结束后，开始流加甲醇实施诱导表达，同时流加85％磷酸溶液，流加速度为12.396ml/h～27.892ml/h，所述的低磷酸浓度的发酵培养基的组成如下：85％H3PO48.9～12.816ml/L，CaSO4·
2H2O0.392～1.175g/L，K2SO46.11～18.2g/L，MgSO4·
7H2O5.6～18.2g/L，KOH1.326～4.13g/L，甘油13.5～40.0g/L，PTM1溶液1.029～4.35ml/L。
[0008]优选地，所述的85％磷酸流加速度为12.396～20.144ml/h。
[0009]优选地，表达重组胶原蛋白的毕赤酵母菌为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，已于2018年9月12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16461，已在中国专利201811589560.X公开。
[0010]本专利技术所述的PTM1溶液采用现有配方，可以是：CuSO4·
5H2O 6.0g/L，NaI 0.08g/
L，MnSO4·
H2O 3.0g/L，NaMoO4·
2H2O 0.2g/L，H3BO
3 0.02g/L，CoCl 0.5g/L，ZnCl
2 20.0g/L，FeSO4·
7H2O 65.0g/L，生物素0.2g/L，H2SO
4 5ml/L。
[0011]优选地，表达重组胶原蛋白的毕赤酵母菌的种液的接种量为8～10％，发酵温度为28～32℃，氨水调节pH为4.8～6.5，基础培养阶段，发酵培养基的溶氧不低于30％。
[0012]优选地，甲醇诱导阶段，发酵培养基的溶氧不低于10％，诱导时间为80～120h，更优选为80～112h。
[0013]优选地，50％甘油流加阶段的目标菌体湿重为190～220g/L。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0015]本专利技术通过在发酵初期即基础培养阶段下调磷酸初始浓度，同时在甲醇诱导表达阶段采取磷酸连续流加的方式，调节巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisJY0201生长代谢，提高重组胶原蛋白合成速率。发酵产量增幅最高可达29.929％，发酵水平最高提升了35.556％，发酵时间可缩短8～16h。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详述。
[0017]本专利技术所述的具体实施例和对比例中，菌株为表达重组胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisJY0201，已于2018年9月12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16461，已在中国专利201811589560.X公开。
[0018]本专利技术所述的PTM1溶液参照Invitrogen公司的毕赤酵母操作手册，具体配方包括：CuSO4·
5H2O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MnSO4·
H2O 3.0g/L，NaMoO4·
2H2O 0.2g/L，H3BO
3 0.02g/L，CoCl 0.5g/L，ZnCl
2 20.0g/L，FeSO4·
7H2O 65.0g/L，生物素0.2g/L，H2SO
4 5ml/L，溶液充分溶解后经0.22μm滤膜过滤除菌。
[0019]实施例1
[0020]发酵培养基：85％H3PO
4 8.9ml/L，CaSO4·
2H2O 1.03g/L，K2SO
4 15.9g/L，MgSO4·
7H2O 15.5g/L，KOH 3.82g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液3.91ml/L。
[0021]重组胶原蛋白的发酵工艺，包括以下步骤：
[0022]将巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisJY0201按照9％的接种量接种于200L发酵罐，培养基体积为130L，培养温度28.9℃，氨水调pH至5.0，溶氧不低于30％，罐压维持0.075MPa，初始搅拌转速为200rpm。培养至DO快速回升至65～75％，补加50％甘油使得菌体湿重达到206～208g/L并且甘油耗尽。停止甘油流加后，进入甲醇流加表达重组蛋白阶段，调节pH至6.2，罐压0.10MPa，溶氧不低于10％，加入甲醇培养基实施诱导表达，同时开始流加85％磷酸，流加速度为20.144ml/h，至甲醇诱导112h发酵终止。甲醇诱导阶段每8h收集发酵液，14000g离心力离心，收集上清HPLC检测重组胶原蛋白浓度。
[0023]实施例2
[0024]发酵培养基：85％H3PO
4 11.169ml/L，CaSO4·
2H2O 1.03g/L，K2SO
4 15.9g/L，MgSO4·
7H2O 15.5g/L，KOH 3.82g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液3.91m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通过调节磷酸浓度和添加方式提高重组胶原蛋白发酵水平的工艺，其特征在于，包括以下步骤：将表达重组胶原蛋白的毕赤酵母菌种液接种到灭菌的低磷酸浓度的发酵培养基中，基础培养12～16小时后，开始流加50％甘油至目标菌体湿重，甘油流加结束后，开始流加甲醇实施诱导表达，同时流加85％磷酸溶液，流加速度为12.396ml/h～27.892ml/h，所述的低磷酸浓度的发酵培养基的组成如下：85％H3PO
4 8.9～12.816ml/L，CaSO4·
2H2O0.392～1.175g/L，K2SO
4 6.11～18.2g/L，MgSO4·
7H2O 5.6～18.2g/L，KOH 1.326～4.13g/L，甘油13.5～40.0g/L，PTM1溶液1.029～4.35ml/L。2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，85％磷酸的流加速度为12.396～20.144ml/h。3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，表达重组胶原蛋白的毕赤酵母菌为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，保藏编...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建民，朱逸丽，赵健烽，吴迎，孙圣，徐鹏程，刘宇乾，刘柯，张力薇，
申请(专利权)人：江苏江山聚源生物技术有限公司，
类型：发明
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