一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法技术

本发明专利技术提供一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌经复壮活化、一级种子、二级种子、30 L种子罐、3 m

【技术实现步骤摘要】
一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法


[0001]本专利技术属于发酵
，具体涉及一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法。

技术介绍

[0002]抗菌肽( Antimicrobi al peptides， AMPs)是生物进化上最古老的抗微生物感染多肽，是从原核生物到人等各种生物先天性免疫调节的重要组成部分，是具有直接抗菌和菌群调节作用的固有免疫效应分子。在历史上，最先认识到抗菌肽的抗菌功能，因此最先将其命名为抗菌肽。随着对该类物质结构和功能的逐步深入认识，近年来已经发现抗菌肽在调节机体免疫应答方面有着非常重要的作用，很多抗菌肽是先天性免疫和获得性免疫的桥梁。抗菌肽通过直接杀菌/抑菌作用和提高机体免疫应答水平而发挥其抗感染作用，这是抗菌肽优于抗菌素之处。因此，目前又将抗菌肽称为免疫防御肽。
[0003]目前的研究表明，抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫、调节机体免疫力等活性，并且不容易产生耐药性。抗菌肽具有多种免疫调节作用，包括调节炎症反应、趋化免疫细胞、促进细胞分化、激活先天性和获得性免疫系统等。抗菌肽的多种免疫调节特性使得其有望成为治疗感染疾病和免疫疾病的药物。
[0004]枯草三十七肽的英文名称为Subl ancin，由37个氨基酸残基组成，分子量为3879.8 D a（按2018年国际相对原子质量），结构中由五个半胱氨酸形成两个二硫键，结构稳定，对高温、酸碱、胃蛋白酶具有良好的抵抗力；实验表明，枯草三十七肽能够增强巨噬细胞R AW264.7的吞噬功能。临床试验表明， 枯草三十七肽能够增强畜禽及水产动物的免疫功能，提高疫苗的免疫效果，安全性高，无药物残留。
[0005]国内外对枯草三十七肽也有一些研究，1998年，P aik SH等对枯草芽孢杆菌168产生的枯草三十七肽的化学和生物学结构特征及转运蛋白基因的鉴定进行了研究，得出枯草三十七肽是由37个氨基酸残基组成的多肽，含有两个二硫键，其水溶液在室温条件下存放两年，没有发生降解和失活，可见其比较稳定。枯草三十七肽虽具有很好的替代传统抗生素的潜力，但枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量很低，不能满足大规模使用的需求。所以，国内外学者一直致力于提高枯草三十七肽产量的研究，Shengyue Ji等通过引入三个特异性启动子，重组枯草芽孢杆菌的操纵子，来提高枯草三十七肽的产量，最终使重组枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量提高到642 mg/L。姬生妖在5 L发酵罐中，采用筛选到的最优培养条件对重组菌株进行培养，枯草三十七肽的产量被进一步提高到968 mg/L。也有专利CN 112029697通过重组枯草芽孢杆菌JY011802发酵将枯草三十七肽的产量提高到3100 mg/L。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是现有技术中利用枯草芽孢杆菌产生枯草三十七肽的产量低，不能满足大规模使用的需求。
[0007]为解决该技术问题，本专利技术提供一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌经复壮活化、一级种子、二级种子、30L种子罐、3m
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种子罐、30m
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发酵罐发酵、在30m
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发酵过程中添加补料、放罐：（1）枯草芽孢杆菌的活化：从
‑
80℃取出枯草芽孢杆菌菌种，复温后，采用划线接种到营养肉汤琼脂平板上，35℃培养12小时；（2）一级种子：从平板上，挑取单个菌落，接种于一级种子培养基中，装量30mL/150mL，于180r/min摇床中37℃培养6～8h，测定发酵液的OD值，达到1.6～1.8后，得到一级种子液；（3）二级种子：从一级种子液中，分别吸取1mL，接种于两个二级种子培养基中，装量100mL/500mL，于220r/min摇床中37℃培养5～7h，测定发酵液的OD值，达到1.7～2.0后，得到二级种子液；（4）30L种子罐：把二级种子液按1%的接种量接种到装有15L的种子培养基的30L种子罐中，以160r/min、罐压0.05MPa，通风量1：1，发酵5～7h，测定发酵液的OD值达3.2～3.6后，得到30L种子罐液；（5）3m
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种子罐：把30L种子罐液按1%的接种量接种到装有1.5m
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的种子培养基的3m
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种子罐中，以160r/min、罐压0.05MPa,通风量1：1，发酵5～7h，测定发酵液的OD值达3.5～4.0后，得到产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液；（6）在30m
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发酵过程中流加补料：在其30m
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发酵过程中根据发酵液的OD值与枯草三十七肽的含量变化流加补料；（7）放罐：放罐时间的确定依据为，发酵32h后，每0.5h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。
[0008]所述菌种活化培养基配方为牛肉膏2g，酵母膏2g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，加水定容至1000mL调pH为7.4；一级种子培养基配方、二级种子培养基配方均为牛肉膏2g，酵母膏2g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，加水定容至1000mL调pH为7.4；30L种子罐、3m
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培养基配方均为酵母浸膏13g/L，蛋白胨10g/L，水溶性玉米淀粉4g/L，玉米浆8g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，其余为饮用水。
[0009]3.如权利要求1所述的高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述30m
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发酵培养基中酵母浸膏浓度为5～10g/L，葡萄糖浓度为0.2～2g/L，水溶性玉米淀粉浓度为2～10g/L，玉米浆浓度为8～20g/L，氯化铵浓度为1～2g/L，氯化钠浓度为1～3g/L，消泡剂浓度为2～5g/L，其余为饮用水；所述补料包含葡萄糖浓度为5～15g/L，玉米浆浓度为4～15g/L，其余为饮用水。
[0010]所述培养基加入发酵罐中的消杀时间为8～12min。
[0011]所述步骤（6）的流加补料方式：在产枯草三十七肽前期根据发酵液OD值调整流加补料量，在产枯草三十七肽中期与后期根据发酵液中枯草三十七肽的含量来调整流加补料量；具体步骤如下： a产枯草三十七肽前期：连续流加补料，具体为，发酵开始4～18h，根据每2h监
测发酵液OD情况流加补料，OD值在2～20之间时，流加补料速率为7～8mL/L
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h；OD值在20～40之间时，流加补料速率为8～10mL/L
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h；OD值在40～60之间时，流加补料速率为10～12mL/L
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h；发酵液OD值在60～80之间时，流加补料速率13～15mL/L
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h；OD值在80～110之间时，流加补料速率18～20mL/L
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h；b产枯草三十七肽中期：连续流加补料，具体为，发酵18～本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将枯草三十七肽的发酵菌种枯草芽孢杆菌经复壮活化、一级种子、二级种子、30L种子罐、3m
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种子罐、30m
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发酵罐发酵、在30m
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发酵过程中添加补料、放罐：（1）枯草芽孢杆菌的活化：从
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80℃取出枯草芽孢杆菌菌种，复温后，采用划线接种到营养肉汤琼脂平板上，35℃培养12小时；（2）一级种子：从平板上，挑取单个菌落，接种于一级种子培养基中，装量30mL/150mL，于180r/min摇床中37℃培养6～8h，测定发酵液的OD值，达到1.6～1.8后，得到一级种子液；（3）二级种子：从一级种子液中，分别吸取1mL，接种于两个二级种子培养基中，装量100mL/500mL，于220r/min摇床中37℃培养5～7h，测定发酵液的OD值，达到1.7～2.0后，得到二级种子液；（4）30L种子罐：把二级种子液按1%的接种量接种到装有15L的种子培养基的30L种子罐中，以160r/min、罐压0.05MPa，通风量1：1，发酵5～7h，测定发酵液的OD值达3.2～3.6后，得到30L种子罐液；（5）3m
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种子罐：把30L种子罐液按1%的接种量接种到装有1.5m
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的种子培养基的3m
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种子罐中，以160r/min、罐压0.05MPa,通风量1：1，发酵5～7h，测定发酵液的OD值达3.5～4.0后，得到产枯草三十七肽的枯草芽孢杆菌种子液；（6）在30m
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发酵过程中流加补料：在其30m
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发酵过程中根据发酵液的OD值与枯草三十七肽的含量变化流加补料；（7）放罐：放罐时间的确定依据为，发酵32h后，每0.5h监测一次枯草三十七肽含量，两次枯草三十七肽含量增量小于50mg/L时，立刻放罐，停止发酵，得到枯草三十七肽发酵液。2.如权利要求1所述的高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述菌种活化培养基配方为牛肉膏2g，酵母膏2g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，加水定容至1000mL调pH为7.4；一级种子培养基配方、二级种子培养基配方均为牛肉膏2g，酵母膏2g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，加水定容至1000mL调pH为7.4；30L种子罐、3m
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培养基配方均为酵母浸膏13g/L，蛋白胨10g/L，水溶性玉米淀粉4g/L，玉米浆8g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，其余为饮用水。3.如权利要求1所述的高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述30m
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发酵培养基中酵母浸膏浓度为5～10g/L，葡萄糖浓度为0.2～2g/L，水溶性玉米淀粉浓度为2～10g/L，玉米浆浓度为8～20g/L，氯化铵浓度为1～2g/L，氯化钠浓度为1～3g/L，消泡剂浓度为2～5g/L，其余为饮用水；所述补料包含葡萄糖浓度为5～15g/L，玉米浆浓度为4～15g/L，其余为饮用水。4.如权利要求1所述的高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述培养基加入发酵罐中的消杀时间为8～12min。5.如权利要求1所述的高密度发酵工业化生产枯草三十七肽的方法，其特征在于，所述步骤（6）...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭柑彤，何涛，牛子义，赵俊峰，刘扬科，
申请(专利权)人：中农颖泰林州生物科园有限公司，
类型：发明
国别省市：