一种提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法，以毕赤酵母基因组为模板，扩增蛋白质二硫键异构酶基因PDI，用BstBI和EcoRI双酶切处理PDI片段，连接至同样经过BstBI和EcoRI双酶切处理的pPIC6αA载体片段，形成表达载体pPIC‑PDI，通过在菌丝霉素表达菌株中表达蛋白质二硫键异构酶，促进菌丝霉素的3对二硫键形成正确的空间结构，进而使菌丝霉素顺利分泌表达至细胞外，达到提高菌丝霉素表达量的目的，使用所述方法使菌丝霉素的表达量提高了30%。

A method to increase the expression of mycophenolate in Pichia pastoris

The invention discloses a method to increase the expression of mycelomycin in Pichia pastoris. The protein two sulfur bond isomerase gene PDI is amplified with Pichia pastoris genome as a template, and the PDI fragment is treated with BstBI and EcoRI double enzymes. The expression of the pPIC6 alpha A carrier fragment, which is also treated with BstBI and EcoRI double enzyme digestion, is formed to form expression. The carrier pPIC PDI, through the expression of protein two sulfur bond isomerase in mymycin expressing strain, promotes the formation of the correct spatial structure of 3 to two sulfur bonds of myceliin, thus making mycelomycin secreted and expressed to the extracellular, to increase the expression of mycelomycin, and to use the method to make the expression of mycelomycin. The increase is 30%.

【技术实现步骤摘要】
一种提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法
本专利技术涉及生物技术和基因工程
，特别涉及一种提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法。
技术介绍
菌丝霉素（Plectasin）是从腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectanianigrella）中分离得到的首例真菌防御素。菌丝霉素对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用，包括：链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、棒状杆菌属和杆状菌属。NZ2114是菌丝霉素的突变体，包含3个氨基酸突变，与菌丝霉素相比，NZ2114突变体对金黄色葡萄球菌的抑制作用提高了30倍。将NZ2114基因转化至毕赤酵母得到PLE-2工程菌株，该菌株可分泌表达菌丝霉素，表达量达到4.9g/l。制备的菌丝霉素样品对金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌、无乳链球菌、诺卡氏菌有明显的抑制作用。具体的菌丝霉素表达菌株构建方法已于2017年10月11日申请中国专利，申请号：201710939331.5，申请名称：《一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母》。毕赤酵母表达系统是最常用的蛋白表达系统之一，已有上千种蛋白质在毕赤酵母中成功表达，并有多种蛋白质实现工业化生产。毕赤酵母表达系统具有遗传背景清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法,其特征在于，包括：A.以毕赤酵母基因组为模板，扩增蛋白质二硫键异构酶PDI基因，双酶切处理PDI片段，连接至同样经过双酶切处理的载体片段，得到蛋白质二硫键异构酶表达载体；B.热激转化步骤A得到的表达载体，涂布于LB抗性平板，培养出单菌落，利用验证引物挑单菌落PCR验证阳性转化子，挑取阳性转化子测序，保存正确菌株与甘油管中；C.单酶切处理蛋白质二硫键异构酶表达载体后，切胶回收线性化表达载体，电转至PLE‑2菌丝霉素毕赤酵母表达菌株，培养至长出菌丝霉素的表达菌株毕赤酵母的单菌落；D.挑取步骤C中所述的菌丝霉素的表达菌株毕赤酵母的单菌落，培养评价菌丝霉素...

【技术特征摘要】
1.一种提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法,其特征在于，包括：A.以毕赤酵母基因组为模板，扩增蛋白质二硫键异构酶PDI基因，双酶切处理PDI片段，连接至同样经过双酶切处理的载体片段，得到蛋白质二硫键异构酶表达载体；B.热激转化步骤A得到的表达载体，涂布于LB抗性平板，培养出单菌落，利用验证引物挑单菌落PCR验证阳性转化子，挑取阳性转化子测序，保存正确菌株与甘油管中；C.单酶切处理蛋白质二硫键异构酶表达载体后，切胶回收线性化表达载体，电转至PLE-2菌丝霉素毕赤酵母表达菌株，培养至长出菌丝霉素的表达菌株毕赤酵母的单菌落；D.挑取步骤C中所述的菌丝霉素的表达菌株毕赤酵母的单菌落，培养评价菌丝霉素的表达，检测发酵上清液的抑菌圈大小，筛选得到PDI菌株；E.将步骤D筛选得到的PDI菌株接种于BMGY培养基中，培养一级种子液；F.取步骤E中培养的一级种子液接种于BMGY培养基中，培养二级种子液；G.将步骤F中的二级种子液接种于含有BSM培养基的发酵罐中，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20%±5%，pH=5.0±0.5，基础甘油耗尽后，流加10%甘油，甘油耗尽后直至溶氧上升至90%，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72小时。2.根据权利要求1所述的提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法，其特征在于，所述的蛋白质二硫键异构酶PDI的基因序列包括如序列表SEQIDNo.1所示的DNA序列。3.根据权利要求1所述的提高毕赤酵母分泌表达菌丝霉素表达量的方法，其特征在于，所述的步骤A中扩增蛋白质二硫键异构酶PDI基因的扩增物分别为：PDI-...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁伟凡，周玉岩，丁小云，李洪金，丘春尚，林绿淼，
申请(专利权)人：广东海纳川生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44