高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开一种高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3蛋白的制备方法，采用不同的培养基对阳性重组子高密度发酵及IPTG诱导表达，以中空纤维滤膜过滤破碎菌体，代替现有的高速离心和死端过滤等操作，有效保证放大后工艺的合理性和可操作性，经镍离子亲和层析、阴离子交换层析及分子筛层析，可获得百克级的rLj‑RGD3原液，其蛋白纯度≥99%，适用于大规模工业化生产。将rLj‑RGD3原液与不同组分配合，通过冷冻干燥制备rLj‑RGD3蛋白，稳定性强。

Preparation method of high yield and high stability of the recombinant gene recombinant Lj RGD3 protein

The invention discloses a preparation method of a high yield and high stability of the recombinant gene recombinant Lj RGD3 protein, using different culture medium on the positive recombinants and IPTG expression induced by high density fermentation, using hollow fiber membrane filtration was broken, replace the existing high speed centrifugation and dead end filtration operation, effectively guarantee the amplification process the rationality and maneuverability, the nickel ion affinity chromatography, anion exchange chromatography and molecular sieve chromatography, can obtain a class rLj RGD3 solution, the protein purity is not less than 99%, suitable for large-scale industrial production. \u5c06rLj\u2011RGD3\u539f\u6db2\u4e0e\u4e0d\u540c\u7ec4\u5206\u914d\u5408\uff0c\u901a\u8fc7\u51b7\u51bb\u5e72\u71e5\u5236\u5907rLj\u2011RGD3\u86cb\u767d\uff0c\u7a33\u5b9a\u6027\u5f3a\u3002

【技术实现步骤摘要】
高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法
本专利技术涉及一种蛋白制备方法，尤其是一种操作简单、纯化率高的高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法。
技术介绍
Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白，已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的中国专利技术专利文献中，即命名为Lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。中国专利号为ZL201310600092.2的专利技术专利公开了一种“去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法”，具体步骤如下：在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以NdeI和HindIII酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定；对阳性重组子进行IPTG诱导表达；对表达的重组蛋白进行提取；对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3 蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a. 在Lj‑RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定，得到阳性重组子；b. 对阳性重组子扩大培养并进行IPTG诱导表达：b.1取单克隆，接种到LB培养基中，30℃培养16~18 小时，至OD600达到2~3；b.2按体积比1:10二级接种于高浓度培养基中，30℃培养2~3小时，至OD600达到1~2；b.3接种到中间转接发酵罐30℃继续培养，待发酵液OD600达到2~3左右时，向培养基中加入发酵体积1/20...

【技术特征摘要】
1.一种高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以NdeI和HindIII酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定，得到阳性重组子；b.对阳性重组子扩大培养并进行IPTG诱导表达：b.1取单克隆，接种到LB培养基中，30℃培养16~18小时，至OD600达到2~3；b.2按体积比1:10二级接种于高浓度培养基中，30℃培养2~3小时，至OD600达到1~2；b.3接种到中间转接发酵罐30℃继续培养，待发酵液OD600达到2~3左右时，向培养基中加入发酵体积1/20的微量元素、发酵体积2/5的葡萄糖、发酵体积1/100的Mg2SO4·2H2O、发酵体积0.2/100的CaCl2·2H2O及终浓度为1mM的IPTG，30℃培养至OD至少为5；所述LB培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L；所述高浓度培养基的组分如下：胰蛋白胨12g/L,酵母粉24g/L，100%甘油4ml/L，柠檬酸7.5g/L，NaCl0.5g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4·3H2O12.5g/L，（NH4）2SO47g/L，H3PO41.5ml/L，消泡剂0.6ml/L；c.收集菌体，经均质机破碎、中空纤维滤膜过滤得上清液；d.所得上清液经镍离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继红，刘高波，吕莉，张欣，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21