一种提高谷胱甘肽累积量的生物方法技术

本发明专利技术提供了一种谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒及其构建方法和应用、一种累积谷胱甘肽方法。本发明专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒包括GSH1，GSH2和fliY序列和两段合适的载体片段。本发明专利技术提供的提高谷胱甘肽累积量的生物方法为，将谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒，即pRSFDuet‑1‑GSH1‑fliY和pBAD24‑GSH2转化到基因缺陷株Δpept，获得重组菌并发酵，最终发酵产物中，谷胱甘肽产量显著高于原始菌株，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗。

A biological method for increasing the accumulation of glutathione

The present invention provides a recombinant plasmid composed of a glutathione synthetase line and a cystine transporter substrate binding protein, as well as its construction method and application, and a method of accumulating glutathione. The recombinant plasmid consisting of the glutathione synthetase line and the cystine transport system substrate binding protein includes GSH1, GSH2 and fliY sequences and two segments of suitable carrier fragments. The biological method for improving the accumulation of glutathione is to convert the recombinant plasmid containing the glutathione synthetase line with the cystine transport system substrate binding protein, namely, pRSFDuet 1 GSH1 fliY and pBAD24 GSH2 to the gene defect strain Delta pept, to obtain the recombinant bacteria and ferment, and finally the fermentation product, cereal caspine. The yield of peptide was significantly higher than that of the original strain, which improved the utilization rate of raw materials, reduced the production cost and energy consumption.

【技术实现步骤摘要】
一种提高谷胱甘肽累积量的生物方法
本专利技术属于生物工程
，具体地说，是关于一株谷胱甘肽合成酶系与表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白相构建的基因缺陷型菌株高产谷胱甘肽的方法。
技术介绍
谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的生物活性三肽化合物，是细胞内重要的抗氧化剂和主要的非蛋白巯基化合物(＞90％)。在生物组织中，谷胱甘肽通过谷胱甘肽还原酶保持氧化型和还原型的动态平衡并发挥细胞保护、物质代谢、信息调控、调节细胞及组织的发育、对抗或诱发疾病等作用，因此，大量应用于医药保健、护肤美容、食品添加等行业。目前GSH的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法和生物酶催化法和生物发酵法。相比之下，生物发酵法具有反应条件温和、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优势，是今后生产谷胱甘肽的主要趋势，但目前大部分研究还停留在实验室阶段，实现商业化生产的国家主要是日本。近来分子生物学的发展也为研究者从分子水平探究、提高GSH产量提供了新思路。L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前体氨基酸之一，细胞内L-半胱氨酸的供应不足严重影响了谷胱甘肽的合成速度及产量。因此可以采用分子生物学方法使L-半胱氨酸大量进入细胞，最终使细胞内谷胱甘肽的合成量增加。此外，同时利用生物体的代谢反应，抑制降解途径可有效提高谷胱甘肽产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒，以用于构建表达谷胱甘肽合成酶系与表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的基因缺陷型菌株。本专利技术还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒的构建方法。本专利技术还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒的应用。本专利技术还有一个目的在于，提供一种抑制谷胱甘肽降解途径的方法。本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒包括GSH1，GSH2和fliY序列和两个合适的载体片段；所述GSH1，GSH2和fliY序列分别如NCBI上GeneID为242378250，253978924和948833的序列所示。根据本专利技术的一个优选实例，在谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的共表达重组质粒中，GSH和fliY编码区置于T7启动子和lac操纵子之间。根据本专利技术的另一个优选实施例，所述谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒分别包括一个卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒的构建方法包括以下步骤：A)PCR扩增获得GSH1，GSH2和fliY序列；B)将GSH1和fliY序列共同克隆入pRSFDuet-1，GSH2克隆入pBAD24。本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒可用于构建表达谷胱甘肽合成酶系与表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的基因缺陷型菌株。本专利技术提供的方法可用于累积谷胱甘肽。本专利技术提供的累积谷胱甘肽的方法通过发酵培养本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系与表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的基因缺陷型菌株，累积谷胱甘肽。根据本专利技术的另一个优选实施例，累积谷胱甘肽的方法还通过，在选择高产菌株后，通过高密度发酵的技术来累积谷胱甘肽。使用本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系与表达胱氨酸转运系统底物结合蛋白的基因缺陷型菌株，可以明显地提高谷胱甘肽生产量，说明此方法，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为进一步研究谷胱甘肽产量建立一种方法，为其产业化生产奠定一种基础。附图说明图1是PCR扩增获得的GSH1，GSH2和fliY的检测结果，其中泳道1为GSH1，泳道2为GSH2，泳道3为fliY。图2是PCR扩增获得的pKD3-Cm的检测结果，其中泳道1为pKD3-Cm。图3是抗性基因Cm去除的PCR鉴定结果，其中泳道1为pept的PCR扩增产物，泳道2为Apept的PCR扩增产物。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：CoLdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自生工生物公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的pMD-19TSimpLeVector，BamHI，XbaI，HindIII，NdeI，EcoRV，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，DNAMarker，均购自TAKARA公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的表达载体pRSFDuet-1，pBAD24，菌种E.coliBL21(DE3)，E.coliDH5α，为中国药科大学生命中心实验室保存，其中菌种E.coliBL21(DE3)的ATCC编号为BAA-1025TM。在本专利技术的下述实施例中，使用的E.coliBL21(DE3)感受态细胞、E.coliDH5α感受态细胞，按照Invitrogen公司PichiaExpressionKit手册中提供的方法进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的LB培养基的配方为：1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸粉，1％NaCl；使用的摇瓶发酵培养基的配方为：1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸粉，1％NaCl。配置固体LB平板培养基时，按照上述配方添加2％琼脂粉。在本专利技术的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照《分子克隆：实验室手册》提供的方法进行。实施例1两个表达质粒的构建1.1引物设计根据NCBI报道的GSH1，GSH2和fliY序列，设计以下6条引物：GSH1UP：CGCGGATCCATGATCCCGGACGTATCACAGGC；GSH1DOWN：CCCAAGCTTTCAGGCGTGTTTTTCCAGCCACACC；GSH2UP：GCTCTAGAGATGATCAAGCTCGGCATCGT；GSH2DOWN：ATGAAGCTTTTACTGCTGCTGTAAACGTGC；fliYUP：GGGCATATGATGAAATTAGCACATCTG；fliYDOWN：CCCGATATCTTATTTGGTCACATCAGC。其中GSH1UP和GSH1DOWN用于扩增GSH1编码区；GSH2UP和GSH2DOWN用于扩增GSH编码区；fliYUP和fliYDOWN用于扩增fliY编码区；GSH1UP、GSH1DOWN、GSH2UP、GSH2DOWN、fliYUP和fliYDOWN上的下划线表示在GSH1UP、GSH1DOWN、GSH2UP、GSH2DOWN、fliYUP和fliYDOWN上分别引入的BamHI、HindIII、XbaI、HindIII、NdeI和EcoRV酶切位点。1.2PCR扩增GSH1，GSH2和fliY序列抽提得到大肠杆菌E.coliK12基因组。以大肠杆菌E.coliK12基因组为模板，分别以步骤1.1中设计的GSH1U本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒，其特征在于，包括GSH1，GSH2和fliY序列和两个合适的载体片段；所述GSH1，GSH2和fliY序列分别如NCBI上Gene ID为242378250，253978924和948833的序列所示，载体片段为pRSFDuet‑1和pBAD24。

【技术特征摘要】
1.一种谷胱甘肽合成酶系与胱氨酸转运系统底物结合蛋白构成的重组质粒，其特征在于，包括GSH1，GSH2和fliY序列和两个合适的载体片段；所述GSH1，GSH2和fliY序列分别如NCBI上GeneID为242378250，253978924和948833的序列所示，载体片段为pRSFDuet-1和pBAD24。2.如权利要求1所述的共表达重组质粒，其特征在于，所述GSH1和fliY序列置于T7启动子和lac操纵子之下。3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述两个重组质粒各包括一段抗性基因片段。4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述抗性基因片段分别为卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。5.权利要求1-4中任一项所述的共表达重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A)PCR扩增获得GSH1，GSH2和fliY序列；B...

【专利技术属性】
技术研发人员：许激扬，卞筱泓，黄艳丽，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32