一种水稻表达载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻表达载体pCA-TUB1-CED-4及其制备方法。本发明专利技术利用已经被报道的TUB1启动子为基础。将TUB1和水稻表达载体的固有启动子融合，构建成了新的水稻表达载体pCA-TUB1-CED-4表达载体，具有诱导目的基因ced-4在水稻表达的优越效果，已筛选到连接正确的载体克隆，并且成功转化到水稻品种：日本晴和丽江新团黑谷。

【技术实现步骤摘要】

本申请属于生物
，具体涉及一种水稻表达载体及其制备方法。
技术介绍
由于线虫细胞凋亡调控基因ced-4在水稻体内不存在，ced-4基因能否在水稻中顺利启动而成功表达目的蛋白，对启动子的科学设计至关重要；即动物体的基因在植物体进行表达，必须解决启动子在线虫与水稻之间的兼容性问题，而且还需要是病原物侵染诱导启动基因表达，这就是本专利的技术目标。从国内外最新的相关研究文献来看，由病原物侵染诱导在单子叶水稻的启动子及其表达载体，未见详细报道。在拟南芥中抗病线虫的诱导启动子tub-1已有研究应用，但尚未见其与目的基因ced-4融合构建水稻表达载体报道。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种水稻表达载体及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术设计了一种水稻表达载体，所述水稻表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示，命名为pCA-TUB1-CED-4。本专利技术还提供了pCA-TUB1-CED-4表达载体的制备方法，所述制备方法如下：（1）将启动子TUB1（SEQ ID NO.6）克隆至pCAMBIA1305.1载体（pCAMBIA1305.1载体为市售），得到中间载体pCA-TUB1，扩增TUB1的引物如下：TUB1FP:AAAGAATTCGCTACATGTGCTATGTCACT（SEQ ID NO.2）；TUB1RP:AAACTGCAGGATGATCGATGAAGATTTTGGG（SEQ ID NO.3）；具体过程是：通过EcoRI和PstI位点插入到pCAMBIA1305.1载体中的EcoRI和PstI（p35S启动子前），得到中间载体pCA-TUB12；（2）将目的基因ced-4克隆至pCA-TUB1载体（通过PstI和PmlI位点），即得所述水稻表达载体，命名为pCA-TUB1-CED-4表达载体；扩增CED-4的引物如下：Ced-4FP:AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC（SEQ ID NO.4）；Ced-4RP:AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGG（SEQ ID NO.5）。本专利技术方法设计的具体克隆方式及酶切等步骤均为本领域常规实验操作。下面对本专利技术作进一步解释：由于CED-4是线虫细胞凋亡主要调控基因表达的蛋白，因此必须考虑这个调控基因如何在水稻中启动表达蛋白。为了解决启动子在线虫和水稻两者的兼容性问题，经过设计和无数次的实验筛选和验证，在前人报道的TUB1基础上，本专利技术构建了以TUB1启动子为基础的表达载体，转化水稻获得转基因水稻，转化水稻苗根部在寄生线虫侵染时可诱导水稻表达CED-4蛋白。本专利技术的表达载体转化水稻的转化苗，在水稻寄生线虫侵染时成功诱导ced-4基因的表达。目前，国内外研究表明TIR结构域蛋白仅发现在双子叶植物存在，其表达也具有相应的启动子，如在拟南芥表达；但在单子叶水稻中尚未发现有TIR结构域蛋白的表达。线虫细胞凋亡TIR结构域蛋白基因，在表达载体中目的基因之前32—45个碱基处加入TUB1诱导序列，在病原线虫侵染时，目的基因启动子可以应答对寄生线虫侵染伤口时启动反应，诱导目的基因表达蛋白增强。因此，进行这一类诱导启动子的设计在理论研究和实际应用中均具有很大的价值。总之，本专利技术利用已经被报道的TUB1启动子为基础。将TUB1和水稻表达载体的固有启动子融合，构建成了新的水稻表达载体pCA-TUB1-CED-4表达载体，具有诱导目的基因ced-4在水稻表达的优越效果，已筛选到连接正确的载体克隆，并且成功转化到水稻品种：日本晴和丽江新团黑谷。附图说明图1为pCA-TUB1-CED-4表达载体酶切图；图2为蛋白杂交检测水稻表达目的蛋白CED-4的电泳图；图中：M为蛋白Marker；泳道5为启动子TUB-1载体转化日本晴苗未接种线虫；6为TUB-1载体转化日本晴苗接种线虫；7为日本晴野生型接种线虫；8为TUB-1载体转化丽江苗接种线虫。具体实施方式实施例1（1）将启动子TUB1（SEQ ID NO.6）克隆至pCAMBIA1305.1载体，得到中间载体pCA-TUB1，扩增TUB1的引物如下：TUB1FP:AAAGAATTCGCTACATGTGCTATGTCACT（SEQ ID NO.2）；TUB1RP:AAACTGCAGGATGATCGATGAAGATTTTGGG（SEQ ID NO.3）；具体过程是：通过EcoRI和PstI位点插入到pCAMBIA1305.1载体中的EcoRI和PstI（p35S启动子前），得到中间载体pCA-TUB12；（2）将目的基因ced-4克隆至pCA-TUB1载体（通过PstI和PmlI位点），即得所述水稻表达载体，命名为pCA-TUB1-CED-4表达载体；扩增CED-4的引物如下：Ced-4FP:AAACTGCAGATGCTCTGCGAAATCGAATGC（SEQ ID NO.4）；Ced-4RP:AAAACTAGTTTAACAGCATGCAAAATTTTTGAGGG（SEQ ID NO.5）。实施例2水稻表达载体的验证构建的水稻表达载体，通过实验各种处理，实验设计及其诱导作用实验步骤及结果如下：（1）转基因水稻苗接种水稻潜根线虫。（2）检测水稻根部表皮细胞凋亡和过敏性反应表型，见染色检测结果统计表。（3）转基因目的基因表达蛋白CED-4检测，见说明书附图。染色测定水稻根部细胞过敏反应方法：水稻根部分别染色15min后以流水充分冲洗去除未结合染料，在50℃下用20mL含50%甲醇和1%SDS的溶液抽提与死细胞结合的染料30min，测定抽提液光吸收值，溴酚蓝染色的测定波长为595nm。具体测定内容为：(a)精确称量不同处理水稻和对照处理的根部组织，每个处理重复3次，每个样品随机取10条水稻根，取相同品种野生型的水稻10条根，甲醇处理15min水稻根部细胞，分别用相同浓度溴酚蓝染色后测定，测定比较不同处理在接种水稻寄生线虫之后对根部表皮发生细胞凋亡的影响；接种水稻潜根线虫的影响（各处理分别接种水稻潜根线虫，在常温22℃的光照培养箱，根部在500条有活力的潜根线虫水溶液接种96小时之后），与未接种线虫的样品分别染色检测比较；（b）用甲醇或乙醇处理，或煮沸处理水稻细胞不同时间后，再用0.03%溴酚蓝染色测定，比较不同处理（野生型、诱导载体、非诱导载体；接种线虫与不接种线虫）水稻根部表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻表达载体，其特征在于，所述水稻表达载体的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述水稻载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
（1）将启动子TUB1克隆至pCAMBIA1305.1载体，得到中间载体pCA-TUB1，扩增TUB1
的引物如下：
TUB1FP:AAAGAATTCGCTACATGTGCTATGTCACT；
TUB1RP:AAACTGCAGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹一平，
申请(专利权)人：宜春学院，
类型：发明
国别省市：