PRV毒力基因突变的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测PRV毒力基因gE、gC、gD、TK的引物组，还公开了所述引物组的用途、包含所述引物组的试剂盒以及使用所述引物组对PRV毒力基因进行PCR扩增的方法。所述的引物组可以专一性的鉴别PRV毒力基因是否突变，该引物组具有高特异性和敏感性，可以确保测定结果的精准，对指导实践生产具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
PRV毒力基因突变的检测方法及检测试剂盒
本专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及PRV毒力基因突变的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies,PR 又名 Aujeszky’s disease, AD)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的多种家畜、野生动物、伴侣动物和实验动物的一种急性传染病。在自然条件下，本病最常见于猪、牛、羊、犬、猫和鼠类。伪狂犬病病毒除对猪以外，对所有易感动物都是致死性病程。对猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、繁殖障碍、生长停滞、失重及高死亡率。哺乳仔猪感染伪狂犬病的临床表现最为典型、严重和一致，均出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100% ;随着年龄增长死亡率逐渐下降，成猪仅为2%，但一般情况下成猪感染不发病，而呈隐形经过，仅见打喷嚏、咳嗽、体温升高等轻微症状；妊娠母猪感染伪狂犬病毒可引起流产、死胎、产弱仔和木乃伊化胎儿；对公猪可引起睾丸鞘膜炎。该病具有高度的传染性，一旦在猪群中发现，将很快通过空气和接触经呼吸道传播给其他猪只和猪场，近来的研究表明伪狂犬病病毒还可以通过乳汁和生殖道感染。不同的伪狂犬病毒具有不同的毒力，据其毒力的不同可以分为:强毒株，普通野毒株，减毒不彻底毒株，减毒完全弱毒株。不同毒力的毒株引起的临床症状不同，强毒株引起的临床症状为:除常见症状外，还可以引起皮肤奇痒。普通野毒株引起的临床症状主要是:繁殖障碍等。减毒不彻底的毒株主要引起:仔猪腹泻、母猪轻微的繁殖障碍。减毒完全弱毒株不致病，安全毒株，所以作为疫苗使用。PRV的毒力的不同由其毒力基因决定，目前国内外对伪狂犬的基因研究表明，影响伪狂犬毒力的主要决定基因集中在gE ，gC，gD, TK, gB, RR这几个基因。经过对现有技术的文献检索发现，目前中国专利技术专利申请并没有关于检测PRV这四个毒力基因的试剂盒，但是近年来，PRV呈现一定的流行性，为了能够更好的监测毒力基因的变化，以分析PRV的毒力变化，研制一种可以快速检测几个毒力基因突变的试剂盒非常有必要。
技术实现思路
因此本专利技术旨在设计一组引物，用于这些基因的扩增，然后对PCR产物进行序列测定，根据结果比对分析出不同毒株之间的差异，并且结合抗原性预测软件分析，可以分析出病毒毒力和抗原性是否发生变化，这可以指导实践用于分子流行病学调查，指导疫苗效力检验，根据预测的结果判断伪狂犬病毒的毒力变化趋势，再结合疫苗的免疫攻毒实验结果指导疫苗的效力检验。本专利技术提供的用于检测PRV毒力基因突变的引物组，包括分别扩增PRV毒力基因gE、gC、gD和TK的引物组，其中，扩增gE的引物组包括SEQ ID N0.1所示序列引物和SEQ ID N0.2所示序列引物的引物组、具有SEQ ID N0.3所示序列引物和SEQ ID N0.4所示序列引物的引物组以及SEQ ID N0.5所示序列引物和SEQ ID N0.6所示序列引物的引物组;其中，扩增gC的引物组包括SEQ ID N0.7所示序列引物和SEQ ID N0.8所示序列引物的引物组以及SEQ ID N0.9所示序列引物和SEQ ID N0.10所示序列引物的引物组；其中，扩增所述gD的引物组包括SEQ ID N0.11所示序列引物和SEQ ID N0.12所示序列引物的引物组以及SEQ ID N0.13所示序列引物和SEQ ID N0.14所示序列引物的引物组；其中，扩增所述TK的引物组为SEQ ID N0.15所示序列引物和SEQ ID N0.16所示序列引物的引物组。本专利技术还提供所述的引物组在检测PRV毒力基因突变中的应用。本专利技术还提供所述的引物组的PRV毒力基因突变检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供一种检测PRV毒力基因突变的方法，其为以PRV的DNA为模板，用所述的引物组进行PCR扩增，将各PCR产物分别测序后，进行序列比对。其中，每25 μ I的反应体系中使用0.5~1.5μ I的引物和50~IOOng的DNA模板，反应条件为:96 ~94°C 预变性 2min ~5min ；96 ~94°C变性 30s ~40s ；60 ~64°C退火 30s ~60s ；72?延伸 30s ~60s ;30-40 个循环；72O延伸 IOmin。本专利技术根据GeneBank中PRV中的gE，gC，gD, TK基因序列进行了特异性的引物设计，所以所扩增的PCR产物可以鉴定出gE，gC，gD，TK四个毒力基因是否发生突变，并且可以确保所扩增的序列的测序结果的准确性和唯一性。本专利技术提供的引物组及试剂盒可以用于检测gE，gC，gD, TK这四个毒力基因是否发生突变，用于分子流行病学调查和指导PRV毒力变化趋势同时可以指导疫苗使用效果的评价，因此具有重要的现实意义。本专利技术不同的毒力基因PCR可以在相同的反应条件和相同的反应体系下完成，全程所花费的时间不到两个小时，扩增产物可以直接进行测序，因此在集中检测PRV样品时具有快速简便的特点。【附图说明】图1为扩增的不同目的基因的PCR产物的电泳结果。图2为用Vector NTI软件分析的gC基因的突变位置。【具体实施方式】`以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1根据NCBI GenBank公布的NC_001651序列公布的gE，gD, gC, TK的序列，设计出用于目的基因gE，gD，gC，TK扩增的PCR引物对，结果见表1。本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测PRV毒力基因突变的引物组，其特征在于，包括分别扩增PRV毒力基因gE、gC、gD和TK的引物组，其中，扩增gE的引物组包括SEQ ID No.1所示序列引物和SEQ ID No.2所示序列引物的引物组、具有SEQ ID No.3所示序列引物和SEQ ID No.4所示序列引物的引物组以及SEQ ID No.5所示序列引物和SEQ ID No.6所示序列引物的引物组；其中，扩增gC的引物组包括SEQ ID No.7所示序列引物和SEQ ID No.8所示序列引物的引物组以及SEQ ID No.9所示序列引物和SEQ ID No.10所示序列引物的引物组；其中，扩增所述gD的引物组包括SEQ ID No.11所示序列引物和SEQ ID No.12所示序列引物的引物组以及SEQ ID No.13所示序列引物和SEQ ID No.14所示序列引物的引物组；其中，扩增所述TK的引物组为SEQ ID No.15所示序列引物和SEQ ID No.16所示序列引物的引物组。

【技术特征摘要】
1.用于检测PRV毒力基因突变的引物组，其特征在于，包括分别扩增PRV毒力基因gE、gC、gD和TK的引物组， 其中，扩增gE的引物组包括SEQ ID N0.1所示序列引物和SEQ ID N0.2所示序列引物的引物组、具有SEQ ID N0.3所示序列引物和SEQ ID N0.4所示序列引物的引物组以及SEQID N0.5所示序列引物和SEQ ID N0.6所示序列引物的引物组; 其中，扩增gC的引物组包括SEQ ID N0.7所示序列引物和SEQ ID N0.8所示序列引物的引物组以及SEQ ID N0.9所示序列引物和SEQ ID N0.10所示序列引物的引物组； 其中，扩增所述gD的引物组包括SEQ ID N0.11所示序列引物和SEQ ID N0.12所示序列引物的引物组以及SEQ ID N0.13所示序列引物和SEQ ID N0.14所示序列引物的引物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢会英，吴星亮，侯艳红，满坤，焦连国，王贵华，赵亚荣，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心， 北京大北农科技集团股份有限公司， 福州大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11