一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法。首先取反应产物60μl行1%琼脂糖凝胶电泳,紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶,按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取2μl回收的DNA与1μl载体PMD18-T连接,总体积10μl,10℃过夜,将连接后PMD18-T转化至DH5α感受态细胞200μl中,铺于LA平板37℃孵育16。本发明专利技术的有益效果是，基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长，成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。?

【技术实现步骤摘要】
—种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法
本专利技术涉及一种生化的实验方法，具体来说，一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法。
技术介绍
血管内皮生长因子C(VEGF -C)属VEGF/PDGF家族成员，其受体为VEGFR -2，VEGFR -3。VEGF通过VEGFR -2调节血管和淋巴管的增生，而VEGFR-3表达则局限于淋巴管内皮，VEGF -C为VEGFR-2的结合，产生生物学效应的所需浓度远高于VEGFR -C，因此，VEGFR -3是淋巴管增生特异性调节因子，用VEGF -C转基因鼠实验证实，VEGF-C的高表达可以选择性地引起淋巴管增生[2]，经研究，VEGF -C表达与肿瘤淋巴管增生和转移的关系是VEGF -C高表达可促进肿瘤的淋巴转移，其机理是VEGF -C促进了肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。为进一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其机制，我们构建了携带人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表达载体，研究了它在真核细胞内的表达，为探讨VEGF -C与淋巴管增生的关系，VEGF -C基因用于治疗淋巴水肿和某些癌肿的可行性提供实验依据。
技术实现思路
为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案:一种真核表达时PCR产物 回收与鉴定的实验方法，取反应产物60 μ 1行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶，按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；取2 μ 1回收的DNA与Ιμ?载体PMD18-T连接，总体积10 μ 1，10°C过夜，将连接后PMD18 -T转化至DH5 α感受态细胞200 μ 1中，铺于LA平板37°C孵育16h;随机挑取LA平板上数个单菌落，分别接种于5ml LA液体培养基中37°C 180r/min震荡过夜，按照提取试剂盒说明提取质粒，并分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，反应体系50 μ 1:质粒20 μ 1，BamH I和EcoR I各1 μ 1，Buffer5μ 1, dH20 23 μ 1, 37°C 水浴酶切 25h, 65°C 水浴 30min ;本专利技术中，随后取10 μ 1反应产物行1 %琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性重组菌落，回收目的基因片段；取lml含阳性重组质粒的菌液。本专利技术的有益效果是，基因测序能够证实RT -PCR产物包含VEGF -C cDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF -C cDNA全长序列，Western -blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF -C蛋白存在。结论:成功构建了人类VEGF -C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。【具体实施方式】首先取反应产物60 μ 1行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶，按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取2μ1回收的DNA与Ιμ?载体PMD18-T连接，总体积10 μ 1，10 °C过夜，将连接后PMD18 -T转化至DH5a感受态细胞200 μ 1中，铺于LA平板37°C孵育16h。随机挑取LA平板上数个单菌落，分别接种于5ml LA液体培养基中37°C 180r/min震荡过夜，按照提取试剂盒说明提取质粒，并分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，反应体系50 μ 1:质粒 20 μ 1，BamH I 和 EcoR I 各 1 μ 1，Buffer 5μ 1, dH20 23 μ 1, 37°C 水浴酶切 25h,65°C水浴30min ;取10 μ 1反应产物行1 %琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性重组菌落，回收目的基因片段。取lml含阳性重组质粒的菌液。 以上所述，仅为本专利技术较佳的【具体实施方式】，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法，其特征在于，取反应产物60μl?行1%琼脂糖凝胶电泳,?紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶,?按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA,?1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；取2μl?回收的DNA?与1μl?载体PMD18?T?连接,?总体积10μl?,?10℃?过夜,?将连接后PMD18??T?转化至DH5α感受态细胞200μl?中,?铺于LA?平板37℃孵育16h；随机挑取LA?平板上数个单菌落,?分别接种于5ml?LA?液体培养基中37℃?180r/min?震荡过夜,?按照提取试剂盒说明提取质粒,?并分别用BamH?I?和EcoR?I?进行双酶切,?反应体系50μl:?质粒20μl,?BamH?I?和EcoR?I?各1μl,?Buffer?5μl,?dH2O?23μl,?37℃水浴酶切25h,?65℃水浴30min。

【技术特征摘要】
1.一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法，其特征在于，取反应产物60 μ 1行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶，按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；取2 μ 1回收的DNA与1 μ 1载体PMD18-T连接，总体积10 μ 1，10°C过夜，将连接后PMD18 -T转化至DH5 α感受态细胞200 μ 1中，铺于LA平板37°C孵育16h ;随机挑取LA平板上数个单菌落，分别接种于5ml LA液体培养基中37°C ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景文，
申请(专利权)人：王景文，
类型：发明
国别省市：