扩增引物、构建表达FTO重组细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一组扩增引物，构建FTO表达构建体的方法，构建重组细胞的方法，以及利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法。其中，所述扩增引物包括：上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′和下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。利用该组扩增引物，能够以显著高的效率提高扩增FTO的效率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一组扩增引物，构建FTO表达构建体的方法，构建重组细胞的方法，以及利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法。其中，所述扩增引物包括：上游引物：5′-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3′和下游引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3′。利用该组扩增引物，能够以显著高的效率提高扩增FTO的效率。【专利说明】扩增引物、构建表达FTO重组细胞的方法及其用途
本专利技术属于生物学领域，更具体的，涉及一组扩增引物，构建FTO表达构建体的方法，构建重组细胞的方法，以及利用重组细胞筛选抗肥胖药物的方法。
技术介绍
目前肥胖症的发病率越来越高，肥胖和超重会导致高血压、II型糖尿病(T2D)、冠状动脉性心脏病等严重疾病，从而大量增加死亡的风险。而且，超重和肥胖的人数有不断增加的趋势。WHO预计到2015年超重人口将增长为23亿，肥胖人口为7亿。美国《保健事务》的研究报告称，中国目前肥胖人口达3.25亿人，增幅超过美国、英国和澳大利亚。目前治疗肥胖的药物主要为奥利司他，其作为强效和长效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，副作用较少，安全可靠而被广泛使用，但是也影响了脂肪的吸收，导致营养失衡。在研的一些减肥药的策略主要集中在降低饮食、抑制热量摄取、刺激产热反应、调节能量代谢和控制神经系统的信号转导上。但是只有美国Arena公司开发Belviq和Vivus公司研制的Qsymia,是近13年来首次获美国FDA批准上市的减肥药(2012年)。面对不断剧增的肥胖群体，减肥药物预示着巨大的收益前景。全基因组关联研究表明，FTO是2007年被证实与肥胖和II型糖尿病具有很强相关性的基因，因此被称为肥胖基因，预示人们对通过它找到治疗肥胖的途径充满了强烈的渴望。动物模型研究表明 ，FTO是决定身体脂肪量必不可少的基因。FTO基因敲除小鼠生长滞后，体重降低，脂肪组织含量减少；FT0过表达小鼠的食物摄取量，体重和脂肪组织含量都显著增加。FTO的蛋白水平研究进一步证实，FTO是一种单链DNA和RNA的去甲基化酶，其生理底物为mRNA的m6A。在FTO大量存在时，m6A由于被FTO催化为A而降低，反之A的含量增加。针对FTO去甲基化酶的特点，已经开发出一些筛选FTO抑制剂的体外生化和细胞水平检测方法。目前，针对FTO药靶的抑制剂研究仅见于2012年的一篇文献(Chen B, Ye F，Yu L, et al.Development of Cell-Active N(6)-Methyladenosine RNA DemethylaseFTOInhibitor.Journal of the American Chemical Society 20120ct ； 134 (43):17963-71)。该报道证实大黄酸(rhein)是FTO的竞争性底物抑制剂，提示可能具有潜在的药用前景。体外的化学研究通过合成FTO作用的底物ssDNA和ssRNA，采用HPLC方法筛选FTO的底物抑制剂；在细胞水平，采用高表达FTO的BE (2)-C细胞，经抑制剂处理后通过LC-MS / MS方法检测mRNA水平m6A / A的比值，确定抑制剂的效果。由此可见，FTO药靶的筛选方法还处于比较初期阶段，主要是针对其去甲基化酶活性开展的一些体外生化实验，以及FTO表达较高的神经细胞内对mRNA的m6A水平评估。还没有针对FTO的其他功能检测方法。本专利技术针对FTO促进脂肪分化的功能提供了一种细胞水平筛选肥胖药物的方法；另外，由于LC-MS / MS方法对仪器设别要求较高，本专利技术采用FTO稳定转染细胞株提供一种采用mRNA免疫斑点杂交通过检测m6A水平筛选药物的方法。然而，目前筛选抗肥胖药物的手段仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个方面提供了一组扩增引物。根据本专利技术的实施例，该组扩增引物包括:上游引物:5'-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3'，下游引物:5'-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3'。专利技术人经过大量的筛选工作，惊奇地意外发现，利用该组扩增引物，能够显著高效率的提高扩增FTO的效率。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种构建FTO表达构建体的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括:I)、利用扩增引物对，对FTO基因进行扩增，以便获得FTO扩增片段；2)、将所述FTO扩增片段与表达载体进行连接，以便获得所述FTO表达载体，其中，所述扩增弓丨物包括:上游引物:5'-CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC-3'，下游引物:5'-CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA-3'。`如前所述，利用该扩增引物能够提高扩增FTO的效率，进而可以进一步提高利用该方法构建FTO表达构建体的方法。在本专利技术中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中与宿主细胞的基因组发生同源重组以获得重组细胞。根据本专利技术的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本专利技术的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本专利技术的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，既可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本专利技术的一个实施例，所述表达载体为真核表达载体。具体的，所述表达载体可以为pcDNA3.1或pEGFPNl。根据本专利技术的实施例，构建体还可以存在其他的元件，以便于构建重组细胞，或者便于提高重组细胞表达FTO的效率和筛选重组细胞的效率。根据本专利技术的一个实施例，构建体可以进一步包含FTO基因的特异性表达启动子，所述启动子与所述FTO扩增片段可操纵地连接。在本专利技术中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本专利技术中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过构建体在宿主细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动FTO基因的转录和表达，并且扩大了宿主细胞的选择范围。根据本专利技术的一个实施例，构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本专利技术中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选重组细胞。根据本专利技术的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本专利技术的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加抗生素例如青霉素、卡那霉素、新霉素例如G418等，则相应连同载体接受并表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组扩增引物，其特征在于，包括：上游引物：5′?CCGCTCGAGATGAAGCGCACCCCGACTGC?3′，下游引物：5′?CCCAAGCTTCTAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA?3′。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭飞马，张美姿，史旺林，张郢，王宁，赵仁滨，谭翼，
申请(专利权)人：航天神舟生物科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：