检测人XPD基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测人着色性干皮病D组(xerodermapigmentosumgroupD，XPD)基因热点突变位点（Lys751Gln）的方法、引物和试剂盒，所述方法和试剂盒利用外侧特异性扩增引物SEQNO1及SEQNO2；内侧特异性测序引物SEQNO3。可检测出XPD基因热点突变位点（Lys751Gln）多态性，特异性好，准确度高。

Method, primer and kit for detecting hot spot of human XPD gene mutation

The invention discloses a method for detection of human xeroderma pigmentosum group D (xerodermapigmentosumgroupD, XPD) gene mutation hotspot (Lys751Gln) method, primer and reagent box, the method and kit primers SEQNO1 and SEQNO2 using lateral specific specific primers SEQNO3 inside. XPD gene hot spot mutation (Lys751Gln) polymorphism can be detected, with good specificity and high accuracy.

【技术实现步骤摘要】
检测人XPD基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及用于检测人着色性干皮病D组(xeroderma pigmentosum group D, XPD)基因热点突变位点(Lys751Gln)的方法、引物和试剂盒，能够对XPD基因突变位点进行检测，特异性好，准确度高，可提高突变检出率。
技术介绍
人着色性干皮病D组(xeroderma pigmentosum group D, XPD)基因又称切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complementing group2, ERCC2),位于第 19 号染色体长臂ql313，有23个外显子，在核苷酸剪切修复过程中负责松解受损DNA双螺旋；且参与基因转录过程，是RNA聚合酶II介导转录过程中不可缺少的组成部分。xro能打开损伤部位的DNA双链，为后续的切除和修复过程提供必要的条件。因而它可识别与修复基因结构无关的大范围损伤，清除体内多种DNA损伤。目前已在xro基因的编码区上发现8个单核苷酸多态性(SNP)位点(4个同义，4个为非同义)，而大部分研究集中在第751密码子的Lys751Gln这个多态性位点。XPD基因第751密码子A —C突变导致Lys751 — Gln751氨基酸替代，大量的研究认为与Lys/Lys基因型相比,携带Lys/ Gln或Gln / Gln基因型可显著降低染色单体型畸变的修复能力。而且不同的种族人群中，这个位点的等位基因频率有很大的差异，如第751密码子Gln/Gln纯合子发生频率在非洲裔美国人为6.9%，而在亚洲人群和高加索人群中分别为1.1%和13.4%。可见人类不同种群的遗传背景是有明显差异的。随着检测技术和检测结果评价的规范化，可以通过检测外周血DNA修复基因XPD第751密码子单核甘酸多态性初步预测不同癌患者对化疗药物的敏感度，从而实现个体化治疗。目前针对XPD基因热点突变位点的检测普遍采用的是聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该方法简便，结果容易判定，但是也同时存在诸多弊端，①靶片段的扩增产物要纯，如有非特异产物(特别是大片段可能含有酶识别序列)将竞争酶活性，使样品消化不完全或及出现酶消化杂带；②酶消化过程要充分(即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证)，避免假阴性结果酶切阳性结果可以确定所检测具体序列，阴性结果仅可说明非酶识别序列，但不能准确判定具体序列。④酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供用快速，准确，高通量地检测XPD基因热点突变(Lys751Gln)的方法、引物和试剂盒。本专利技术提供用于检测检测人xro基因热点突变位点的引物，所述引物包括: (1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ NOl和SEQ N02，其碱基序列为:SEQ NOl: TCTGGATTATACGGACATCTC ；SEQ N02:Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT (2)—条特异性内侧测序引物SEQ N03，其碱基序列为:SEQ N03:GCTAGAATCAGAGGAGACG.。进一步地，所述突变位点为Lys751Gln。 本专利技术还提供一种用于检测检测人xro基因热点突变位点的方法，所述方法包括: (i )提取样品中的DNA ； (ii)利用一对特异性外侧扩增引物SEQNOl和SEQ NO 2，进行PCR扩增，获得扩增产物，其中 SEQ NOl:TCTGGATTATACGGACATCTC ；SEQ N02:Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT ； (iii)将(ii)中的扩增产物进行电泳鉴定，确定是否扩增成功； (iv)若扩增成功，利用一条特异性内侧测序引物SEQN03对所述扩增产物进行焦磷酸测序，获得所述扩增产物的基因序列，其中SEQ N03:GCTAGAATCAGAGGAGACG.； (v)将所述基因序列与人XPD基因第23外显子野生型基因序列进行比对，判断是否存在热点突变位点。优选地，步骤(ii)的PCR 扩增反应条件为 94°C 5min ；98°C 30s、58 °C 30s, 68 °C30s, 35 个循环；最后 68°C 5min。本专利技术还提供一种用于检测人XPD基因热点突变位点的试剂盒，包括血液DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于:所述PCR扩增反应液包括一对用于扩增人XPD基因第23外显子的外侧特异性扩增引物SEQ NOl和SEQ N02，其碱基序列为:SEQ NOl: TCTGGATTATACGGACATCTC ；SEQ N02:Biot i n-TCACCTGACTTCATAAGACCT 所述焦磷酸测序反应液包括一条内侧特异性测序引物SEQ N03，其碱基序列为:SEQ N03: GCTAGAATCAGAGGAGACG.。进一步地，所述PCR扩增反应液还包括2*PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNAPolymerase 和 ddH20。进一步地，所述阳性对照品为含有人XPD基因纯合突变样本DNA的溶液，所述阴性对照品ddH20，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。本专利技术根据XPD基因热点突变位，设计了第23外显子PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物。虽然特异性扩增引物与测序引物均是通过专业的软件设计，但通过软件设计往往会有很多对引物，要综合分析判断，还要在试验中验证，引物很关键，对扩增产物以及测序位点的特异性、准确性有重大影响，不同引物对扩增出来的产物质量及突变位点的峰形判读是有差异的。本专利设计的引物是通过精密分析，反复验证而选择出来的最佳引物对，保证了准确性和特异性。所设计出的扩增产物和测序引物的序列如表1所示。表1.第23外显子引物序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测检测人XPD基因热点突变位点的引物，所述引物包括：(1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ?NO1和SEQ?NO2，其碱基序列为：SEQ?NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；SEQ?NO2：Biotin?TCACCTGACTTCATAAGACCT(2)?一条特异性内侧测序引物SEQ?NO3，其碱基序列为：SEQ?NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。

【技术特征摘要】
1.用于检测检测人Xro基因热点突变位点的引物，所述引物包括: (1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ NOl和SEQ N02，其碱基序列为:SEQ NOl:TCTGGATTATACGGACATCTC ；SEQ N02:Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT (2)—条特异性内侧测序引物SEQ N03，其碱基序列为:SEQ N03:GCTAGAATCAGAGGAGACG.。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述突变位点为Lys751Gln。3.一种用于检测检测人xro基因热点突变位点的方法，所述方法包括: (i )提取样品中的DNA ； (ii)利用一对特异性外侧扩增引物SEQNOl和SEQ NO 2，进行PCR扩增，获得扩增产物，其中 SEQ NOl:TCTGGATTATACGGACATCTC ；SEQ N02:Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT ； (iii)将(ii)中的扩增产物进行电泳鉴定，确定是否扩增成功； (iv)若扩增成功，利用一条特异性内侧测序引物SEQN03对所述扩增产物进行焦磷酸测序，获得所述扩增产物的基因序列，其中SEQ N03:GCTAGAATCAGAGGAGACG.； (v)将所述基因序列与 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛群，李文静，王淑一，徐建成，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：