一种用于检测PRV的荧光定量PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种特异性检测猪伪狂犬病病毒（PRV）感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’-GAGGACGACGGGCTGTAC-3’，特异性引物对的下游引物序列为5’-GGACATCAACAGGCGGTTG-3’，所述TaqMan探针的序列为5’-TGGGTCCATTCGTCACTTCCG-3’，且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。本发明专利技术的试剂盒可用于快速定性定量检测PRV感染、鉴别检测PRV?gE基因缺失疫苗毒株和/或PRV野毒株。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种特异性检测猪伪狂犬病病毒（PRV）感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’-GAGGACGACGGGCTGTAC-3’，特异性引物对的下游引物序列为5’-GGACATCAACAGGCGGTTG-3’，所述TaqMan探针的序列为5’-TGGGTCCATTCGTCACTTCCG-3’，且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术的试剂盒可用于快速定性定量检测PRV感染、鉴别检测PRV?gE基因缺失疫苗毒株和/或PRV野毒株。【专利说明】—种用于检测PRV的荧光定量PCR试剂盒及其应用
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒及其应用。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies, PR)又称为Aujeszky氏病，由疱疫病毒科α -疱疫病毒亚科伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的一种急性传染病，其中，猪、牛、羊等多种家畜及野生动物为该病毒的主要感染对象，并表现发热、奇痒、脑脊髓炎等感染症状。伪狂犬病最早于1902年报道于匈牙利，自此广泛流行于世界各地。我国在1947年首次报道该病以来，迄今为止，相继20多个省份开始流行该病(李素莲.对伪狂犬病基因缺失疫苗株研究的思考.四川畜牧兽医，2001，3 (28):27-29.)。猪是伪狂犬病病毒的主要宿主及传染源，健康阴性猪与病猪、带毒猪直接接触均可感染该病。妊娠母猪感染伪狂犬病病毒通常会引起流产、木乃伊胎、死胎和产弱仔；哺乳仔猪感染伪狂犬病病毒则多发为神经症状，呈化脓性脑炎；保育猪及育肥猪感染伪狂犬病病毒则多发为呼吸系统症状；成年猪感染伪狂犬病病毒则多为隐性感染；2周龄以内仔猪感染伪狂犬病病毒的发病死亡率可达100%。目前，伪狂犬病病毒感染已经成为严重危害养猪业的重大疾病之一，并给全球养殖业尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。目前，常用于检测PRV的方法包括血清学实验、体内潜伏病毒的激活与检测技术、组织块培养及共培养技术、核酸杂交技术和PCR技术等。其中，血清学试验方法存在费时、费力、准确率低等缺陷；组织块培养及共培养技术中的病毒分离具有敏感、特异等优点，但存在耗时较长(约3周)，操作繁琐等缺陷。虽然分子生物学的常规方法在某些方面可以弥补前述检测方法的不足，但存在假阳性、环境污染、重现性不高等缺陷，从而限制了其推广应用。近年来，新兴的实时荧光定量PCR技术在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性的荧光探针或荧`光染料，利用能够实时监测的荧光PCR仪来检测病原体靶核苷酸序列，该技术不但克服了传统PCR技术存在的缺点，且具有结果直观可靠、特异性强、灵敏度高、快速简单等优点，可以直观地从分子生物学水平检测到病毒核酸的存在，已成为临床上检测和诊断疾病的重要技术。并且，实时荧光定量PCR技术在检测伪狂犬病方面已用于检测PRV感染猪和潜伏感染猪，还能快速检验区分猪伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒，甚至可以定量检测感染PRV的感染量(万超，温国元，潘兹书等.快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用.中国病毒学，2006，21 (5) =485-489.;赵丽，崔保安，陈红英等.鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立.生物工程学报，2008，24 (7):1149-1154.)。实时荧光定量PCR技术包括染料法和探针法两种，其中，染料法是利用能与双链DNA结合的染料(如SYBR Green)结合到双链DNA产物内部，再根据检测到的荧光信号实现定量检测的目的，但存在无法区分引物二聚体及非特异产物信号的缺陷；探针法是在常规的PCR基础上加入一条特异性的荧光探针(如TaqMan探针)，根据探针两边标记的报告荧光基团和荧光淬灭基团之间产生的荧光共振能量转移原理，释放的荧光信号强度与扩增产物的量呈正比关系而实现定量检测。实时荧光定量PCR技术的优越性对我国大型集约化养猪业中水平净化PRV具有十分重要的意义。但是，实验室人员在使用实时荧光定量PCR技术时，通常需要分别购买荧光染料和酶体系，并花费大量时间用于设计合适的引物探针和优化反应体系等工作，且在目前的临床检测或科研实践中，尚没有开发出一种通过简单操作即能实现快速检测PRV的试剂盒产品，且实时定量PCR检测技术的准确性、特异性、灵敏度和重现性等方面均存在不能满足现实需要的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性检测猪伪狂犬病病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5 ’ -GAGGACGACGGGCTGTAC-3 ’ (SEQ ID NO:1 )，特异性引物对的下游引物序列为 5’ -GGACATCAACAGGCGGTTG-3’ (SEQ ID NO:2)，所述 TaqMan 探针的序列为5’-TGGGTCCATTCGTCACTTCCG-3’ (SEQ ID NO: 3)，且 TaqMan 探针的 5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQl，优选用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对的数量为至少一对，更优选特异性的TaqMan荧光标记探针的数量为至少一条。本专利技术的优选技术方案中，所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中，其中，所 述PCR反应液是由IXPCR Buffer、0.5mmol/L的dNTP混合物、0.1 μ mol/L的TaqMan探针、0.2 μ mol/L的上游引物、0.2 μ mol/L的下游引物和适量的无菌双蒸水组成。本专利技术的优选技术方案中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品的任一组份或其组合。本专利技术的优选技术方案中，所述的阳性质控品为含有猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列的T载体质粒。本专利技术的特异性检测猪伪狂犬病病毒感染的荧光定量PCR的主要技术原理:实时荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中产物量的变化。本专利技术的目的在于提供本专利技术的荧光定量PCR试剂盒用于快速定性定量检测猪伪狂犬病病毒的方法中的应用，优选用于鉴别检测PRV gE基因缺失疫苗毒株和PRV野毒株的任一种或其组合。本专利技术的目的在于提供本专利技术的荧光定量PCR试剂盒用于检测待检样本中是否存在猪伪狂犬病病毒DNA的方法中的应用。本专利技术的目的在于提供本专利技术的荧光定量PCR试剂盒用于快速定性定量检测猪伪狂犬病病毒的方法中的应用，优选用于快速定性定量检测猪伪狂犬病病毒的感染或猪伪狂犬病病毒感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪伪狂犬病病毒拷贝数。本专利技术的目的在于提供一种利用荧光定量PCR技术特异性检测猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的方法，包括下述步骤:I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性检测猪伪狂犬病病毒（PRV）感染的荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’?GAGGACGACGGGCTGTAC?3’，特异性引物对的下游引物序列为5’?GGACATCAACAGGCGGTTG?3’，所述TaqMan探针的序列为5’?TGGGTCCATTCGTCACTTCCG?3’，且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1，优选用于扩增猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域的特异性引物对的数量为至少一对，更优选特异性的TaqMan荧光标记探针的数量为至少一条。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛霜，陈其兵，朱薇，李晶梅，漆世华，温文生，谢红玲，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：