本发明专利技术涉及结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用。具体地，本发明专利技术基于GST融合表达的高通量功能蛋白筛选技术，筛选到46个能被结核病病人血清识别的阳性抗原，其中5个抗原呈现强阳性反应。血清学检测表明，用这些阳性抗原检测结核杆菌具有高敏感性和特异性。本发明专利技术还提供了相应的诊断和监测结核病的方法和试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用。具体地，本专利技术基于GST融合表达的高通量功能蛋白筛选技术，筛选到46个能被结核病病人血清识别的阳性抗原，其中5个抗原呈现强阳性反应。血清学检测表明，用这些阳性抗原检测结核杆菌具有高敏感性和特异性。本专利技术还提供了相应的诊断和监测结核病的方法和试剂盒。【专利说明】结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及结核杆菌重要抗原的高通量筛选及其在结核病诊断中的应用。
技术介绍
结核病(Tuberculosis，TB)是世界上单一致病菌引起死亡最多的疾病。据WHO估计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB),每年有约200万人死于结核病。中国是22个结核病高负担国家之一，占全球结核病病例的80%。目前全国有1/3以上的人口感染了结核分枝杆菌，其中活动性结核患者450万，每年约25万人死于结核病，居各类传染病之首。近年来，随着耐药结核病的流行和TB-HIV共感染，全球结核疫情进一步加重。尽管世界卫生组织倡导直接观察下的治疗(the directly observed therapy, DOTS),大大缩短了治疗周期，但目前仍然无法快速确诊病例进行早期干预和治疗，成为结核病疫情预防和控制的绊脚石。结核分枝杆菌不同于其他细菌，其生长极为缓慢，且为胞内寄生，因此易形成潜伏感染和耐药菌株，致病性主要与细菌感染和细胞免疫造成的免疫病理损伤有关。目前实验室诊断归纳为三类:病原学诊断、核酸诊断和免疫学诊断。病原学诊断以痰涂片镜检和细菌培养为基石，是临床常规诊断方法。其中痰涂片镜检敏感性约为35~80%，合并感染HIV阳性病例敏感性降至20%，对儿童TB和肺外TB的检出率更低。细菌培养作为诊断的“金标准”，需要生物安全设施，且耗时长，一般需2~8周完成，在一般医院难以开展 。近年来，应用分子生物学和免疫学方法研发新型诊断技术已成为研究的热点。分子生物学是以核酸扩增为原理，检测MTB特异性核酸，虽然特异性有所提高，但敏感性差异较大，易出现“假阳性”。2010年底，WHO推荐Xpert MTB/RIF (C印heid)技术作为一种全新快速核酸扩增检测MTB方法，其优点是检测痰标本，操作简单，检测时间缩短至2小时，但难以区分活性TB和潜伏TB。检测仪器昂贵，检测费用动则上千元，限制了其在发展中国家应用。免疫学诊断方法是检测外周血特异性抗原或抗体，或者外周血特异性T细胞。特异性T细胞检测主要为传统的结核菌素实验，此方法因难以区分卡介苗免疫和TB现症感染，其应用目前局限于5岁以下儿童免疫接种效果的监测。近年开发的Y-干扰素的释放(interferon gamma release test, IGRAs),包括试剂盒 QuantiFERON-TB Gold In-Tubetest (QFT-GIT) (Cellestis)以及 T-SP0T.TB test (T-Spot) (Oxford)，是检测患者对MTB 的特异性细胞免疫反应，即用MTB特异抗原ESAT-6、CFP-10和TB7.7刺激患者外周血T细胞后检测Y -干扰素的释放。QFT-GIT和T-Spot的检测敏感性约为76%和60%，特异性约为61%和52%，能够区分卡介苗免疫和TB现症感染，但难以区别潜伏感染和活动性TB。对儿童TB的检测显示，IGRAs并不适用于5岁以下儿童的TB诊断。目前这类试剂盒价格十分昂贵，在我国其应用受限于科研，难以在临床推广应用。检测外周血特异性抗原或抗体方法多是基于传统的酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)。相比较而言，ELISA 技术简便快速,可操作性强，因此广泛应用于临床免疫学检验。应用ELISA等免疫诊断技术达到理想敏感性和特异性的关键是筛选到特异性的理想抗原或抗体。由于MTB抗原远较病毒复杂，其又与牛结核分枝杆菌(卡介苗)和非结核分枝杆菌抗原谱接近，而卡介苗人群免疫率高，因此筛选MTB特异的、有效区分活动性TB和潜伏TB的理想抗原是研发的关键。近年来利用比较基因组学和蛋白质组学研究，筛选到了一些MTB特有的而BCG、其他非结核分枝杆菌缺失的抗原，例如RDl到RD16区的分泌抗原ESAT-6、CFP-10等。采用单一、重组或融合抗原检测血清抗体的敏感性为1%~60%，特异性为53%~99%，未能区分活性和潜伏感染。这与MTB引起慢性感染，TB患者细菌载荷与疾病的进程影响TB患者抗体谱多样性密切相关。如何在结核高负荷的国家和地区，采用简便、快速、灵敏，仅需简单技术和设备的现场诊断方法(point of care，P0C)，是世界卫生组织、结核组织联盟和比尔盖茨基金会等以及我国政府“十二五”规划致力解决的重大技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种结核杆菌重要抗原及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种结核杆菌阳性抗原，所述抗原选自:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-46所示的多肽:(b)将SEQ ID NO: 1-46氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽； (c)与SEQ ID NO:1_46所示氨基酸序列的同源性≥90% (较佳地≥95%，更佳地^ 98%，最佳地> 99%)的、具有免疫原性的多肽；或(d)多肽(a) —多肽(C)的具有免疫原性的活性片段；在另一优选例中，所述阳性抗原为氨基酸序列如SEQ ID N0:l_5任一所不的多肽；较佳地，所述抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽。在本专利技术的第二方面，提供了第一方面所述阳性抗原的用途，它被用于制备检测结核杆菌的试剂或试剂盒。 在本专利技术的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组:(a)编码第一方面所述阳性抗原的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸.在另一优选例中，所述的多核苷酸为编码SEQ ID NO: 1-5任一所示的(较佳地编码SEQ ID NO:1所示)氨基酸序列的多核苷酸。在本专利技术的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有第三方面所述的多核苷酸。在本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有第四方面所述的载体，或其染色体整合有第三方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在本专利技术的第六方面，提供了一种制备结核杆菌阳性抗原的方法，包括步骤:(a)在适合表达的条件下，培养第五方面所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的结核杆菌阳性抗原。在另一优选例中，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-5任一所示；较佳地，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在本专利技术的第七方面，提供了一种检测结核杆菌的试剂盒，包括组分:组分⑴:一容器或载体；以及组分(ii):位于所述容器内或载体上的第一方面所述的阳性抗原。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书；较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分:反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。在本专利技术的第八方面，提供了一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核杆菌阳性抗原，其特征在于，所述抗原选自：(a)氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1?46所示的多肽：(b)将SEQ?ID?NO:1?46氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；(c)与SEQ?ID?NO：1?46所示氨基酸序列的同源性≥90%（较佳地≥95%，更佳地≥98%，最佳地≥99%）的、具有免疫原性的多肽；或(d)多肽(a)－多肽(c)的具有免疫原性的活性片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫庆，徐新东，周方斌，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：
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