二氧化锆四氧化三铁纳米颗粒的制备及其富集磷酸肽的方法技术

钙的缺乏和吸收效率低已成为全球性问题，已被证明磷酸化肽能有效地促进人体对钙的吸收，因此寻找高效快捷的磷酸肽富集方法则具有重要意义。以磁性纳米颗粒为吸附载体对目标物质进行分离纯化是一项新兴的分离纯化技术，通过对磁性纳米颗粒的表面修饰改性，特定地分离纯化目标物质，在外加磁场的作用下，从复杂的体系中实现快速分离。与传统方法相比，磁分离技术具有操作简单、快速、高效富集、高回收率等优点。本发明专利技术首先提供了一种金属氧化物磁性纳米颗粒的制备方法，制备的二氧化锆四氧化三铁磁性纳米颗粒用于磷酸肽的富集。本发明专利技术制备的二氧化锆四氧化三铁纳米磁性颗粒具有超顺磁性及良好的水分散性，对磷酸肽的吸附显示出高特异性。建立在此金属氧化物磁性纳米颗粒础上的磷酸肽的富集明显优于传统方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】钙的缺乏和吸收效率低已成为全球性问题，已被证明磷酸化肽能有效地促进人体对钙的吸收，因此寻找高效快捷的磷酸肽富集方法则具有重要意义。以磁性纳米颗粒为吸附载体对目标物质进行分离纯化是一项新兴的分离纯化技术，通过对磁性纳米颗粒的表面修饰改性，特定地分离纯化目标物质，在外加磁场的作用下，从复杂的体系中实现快速分离。与传统方法相比，磁分离技术具有操作简单、快速、高效富集、高回收率等优点。本专利技术首先提供了一种金属氧化物磁性纳米颗粒的制备方法，制备的二氧化锆四氧化三铁磁性纳米颗粒用于磷酸肽的富集。本专利技术制备的二氧化锆四氧化三铁纳米磁性颗粒具有超顺磁性及良好的水分散性，对磷酸肽的吸附显示出高特异性。建立在此金属氧化物磁性纳米颗粒础上的磷酸肽的富集明显优于传统方法。【专利说明】
本专利技术涉及纳米材料和蛋白质分离纯化
，特别涉及。
技术介绍
钙是人体中含量最多的微量元素，被称为人体的“环境卫士”，具有重要的生理功能，包括:轻度抑制甲状腺机能亢进，预防异位钙化和骨化，减少结肠癌的复发率以及减少高血压病的发生。长期缺钙会导致骨骼和牙齿发育不全、骨质疏松症、贫血，甚至高血压和冠心病。而我国居民平均每日钙摄入量只有400mg左右，只占每日推荐量的50 %左右，因此补钙是当务之急。1950年，Mellander及其同事首次利用胃蛋白酶和胰酶作用于酪蛋白得到了一种富磷多肽，并将之命名为酪蛋白磷酸化肽(简称CPP)。CPP能抵抗蛋白酶的进一步分解，与Ca、Fe离子具有亲和性，并且在生理pH值下，无论正常婴儿还是佝偻病患儿对酪蛋白磷酸化肽的钙盐比自然状态下的钙都能更好的吸收。酪蛋白磷酸化肽作为目前唯一一种可作为食品添加剂的促钙吸收的活性肽，其在中国具有巨大的发展潜力。因此，工业化生产酪蛋白磷酸化肽在生产实践中即具有重要的影响。卵黄高磷蛋白磷酸肽(简称PPP)是从卵黄高磷蛋白中提取的一种多种短肽的混合物，其主要生物学功能是促进钙、铁和锌等金属离子的吸收。有学者研究PPP-钙对受试小鼠的钙表观吸收率的影响表明，其钙的吸收量达到8.446-11.375%，能有效地促进钙的吸收。InwookCetal (2005)指出PPP中含有的磷酸化丝氨酸残基比CPP多，且证明出PPP在抑制钙形成不溶性的化合物方面优于商品化的CPP。因此可见PPP在促进钙等矿物质吸收方面显示出广阔的应用潜力。因此，寻找一种高效、安全、成本低，工艺简单的磷酸化肽的富集方法则尤为重要。目前磷酸肽的富集方法主要有乙醇钙沉淀法，离子交换法和膜分离法，而这三种方法在实际应用上都存在一定的不足:乙醇钙沉淀法溶剂消耗量大，且存在有机溶剂残留问题；离子交换法需要大量的酸液碱液再生，对周围的水体环境和大气环境均会造成较大程度的污染；而膜分离法对设备条件要求很高，膜的清洗和维护也是相当关键，且工序较为繁琐。固定化金属离子亲和色谱由Porath于1975年首先提出，经过几十年的发展，已经成为目前最为普及的磷酸化肽富集方法。以磁性纳米颗粒为吸附载体对目标物质进行分离纯化是一项新兴的分离纯化技术，通过对磁性纳米颗粒的表面修饰改性，特定地分离纯化目标物质，在外加磁场的作用下，从复杂的体系中实现快速分离。与传统方法相比，磁分离技术具有操作简单、快速、高效富集、高回收率等优点。四氧化三铁磁性纳米颗粒毒性较低，制备方法简单，当粒径小于30nm时，则表现出超顺磁性，即在外加磁场作用下具有较强的磁响应性，当撤离磁场时，磁性迅速消失，剩磁为零，不会被永久磁化。到目前为止，尚未有采用金属氧化物磁性纳米颗粒作为吸附载体用于食品级CPP和PPP富集的报道。本专利技术制备合成了形貌规整，粒径均一的超顺磁性二氧化锆四氧化三铁纳米颗粒，并将其应用于磷酸肽的富集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供二氧化锆四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，制备的颗粒形貌规整、粒径均一、磁响应性强，具有良好的生物相容性。采用所制备的二氧化锆四氧化三铁纳米颗粒富集磷酸肽，操作简便、成本低廉，生产周期短，且易于工业化大规模生产，解决了传统磷酸肽富集困难、步骤繁多等问题。本专利技术提供的二氧化锆四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及其富集磷酸肽的方法，其实施方案如下:1.二氧化锆(ZrO2)四氧化三铁磁性纳米颗粒(简写为Fe3O4OZrO2)的制备采用化学共沉淀法合成，其化学反应式为:Fe2++2Fe3++8NH3.H2O = Fe3O4 I +8NH4++4H20步骤如下:(I)将可溶性的Fe2+和Fe3+(总铁离子浓度为0.01?0.5M)溶解在水-无水乙醇混合溶液中，在机械搅拌下通氮气10?50min。(2)将温度升高到40?70°C，在搅拌状态下缓慢滴加氨水溶液到体系中，调节体系的pH值到10?11左右，得到黑色的含磁性颗粒溶液。(3)在搅拌状态下迅速加入质量比1%?50%氧氯化锆溶液，升温到70?90°C反应I?2h,终止反应,静置冷却，得反应液。(4)在外加磁场的作用下分离磁性颗粒，并且用去离子水清洗数次至中性，去除未反应完全的化学组分。(5)对收集到的磁性颗粒进行冷冻干燥处理，即可得Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒粉末。采用上述方法成功实现了 ZrO2与四氧化三铁的偶联，且方法制备的Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒形貌规整，粒径均一，具有超顺磁性，同时在水溶液中具有良好的分散性。2.权利要求1方法制备得到的Fe304@Zr02磁性纳米颗粒的应用，其特征在于用于富集CPP，步骤如下:(I)制备酪蛋白磷酸肽的吸附原液:取新鲜牛奶，调pH至4.6以便沉降酪蛋白，过滤得到酪蛋白粗品。将酪蛋白粗品水解得到CPP的吸附原液。(2)富集磷酸肽:将Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒加入到含有CPP的吸附原液中，在一定温度下搅拌反应一定时间，使溶液中的CPP特定地吸附在Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒表面，在外加磁场的作用下将吸附有CPP的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来，用去离子水清洗三次去除杂质，再用洗脱液进行洗脱，收集磷酸肽的洗脱液，测定N/P。3.权利要求1方法制备得到的Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒的应用，其特征在于用于富集PPP，步骤如下:(I)制备卵黄高磷蛋白磷酸肽的吸附原液:取新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离，将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清，用针挑破膜，收集蛋黄内容物，之后进行喷雾干燥，得蛋黄粉。将蛋黄粉经一系列的脱脂、脱磷、酶解处理得到PPP的吸附原液。(2)富集磷酸肽:将Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒加入到含有PPP的吸附原液中，在一定温度下搅拌反应一定时间，使溶液中的PPP特定地吸附在Fe3O4OZrO2磁性纳米颗粒表面，在外加磁场的作用下将吸附有PPP的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来，用去离子水清洗三次去除杂质，再用洗脱液进行洗脱，收集磷酸肽的洗脱液，测定N/P。本专利技术的有益效果:本专利技术制备了一种金属氧化物磁性纳米颗粒，并将其应用于CPP和PPP的富集。建立在此金属氧化物磁性纳米颗粒基础上的CPP和PPP的富集，其N/P下降相当显著。CPP可由提纯前的42.53降低到6.53?7.37，PPP可由提纯前的39.49降低到6.45?8.15,明显优于目前所报道的传统的富集方法。另外，本专利技术提供的金属氧化物磁性本文档来自技高网...

【技术保护点】
二氧化锆四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及其富集磷酸肽的方法，包括以下几个步骤：?二氧化锆(ZrO2)四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备(简写为Fe3O4@ZrO2)采用化学共沉淀法合成，其化学反应式为：?Fe2++2Fe3++8NH3·H2O＝Fe3O4↓+8NH4++4H2O?步骤如下：?(1)将可溶性的Fe2+和Fe3+溶解在不同体积比的水?无水乙醇混合溶液中，在机械搅拌下通氮气10～50min。?(2)将温度升高到40～70℃，在搅拌状态下缓慢滴加氨水溶液到体系中，调节体系的pH值到10～11左右，得到黑色的含磁性颗粒溶液。?(3)在搅拌状态下迅速加入一定量的氧氯化锆溶液，升温到70～90℃反应1～2h，终止反应，静置冷却，得反应液。?(4)在外加磁场的作用下分离磁性颗粒，并且用去离子水清洗数次至中性，去除未反应完全的化学组分。?(5)对收集到的磁性颗粒进行冷冻干燥处理，即可得Fe3O4@ZrO2磁性纳米颗粒粉末。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨严俊，苏宇杰，汪家琦，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：