【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程和基因工程，具体涉及到一种具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用。
技术介绍
1、胆汁是肝脏分泌的等渗电解质液体，其化学结构具有c-3位的α-羟基团，是脂质丰富的肝脏分泌物,对于排除体内的胆固醇和异物以及促进上小肠消化吸收脂肪都必不可少。
2、胆汁由胆汁酸、磷脂、蛋白质、胆固醇和胆红素等组成。首要胆汁酸胆酸和鹅去氧胆酸约占胆汁酸的50％，次要胆汁酸脱氧胆酸和丙酸占较小比例。胆汁酸是由肝脏的胆固醇合成，并与甘氨酸和牛磺酸结合成为胆汁酸。人体血清中正常胆汁酸范围为0-10μmol/l，当肝功能受损或肝肠循环发生故障时，血液中总胆汁酸浓度就会上升，预示人体肝脏相关功能损伤。肝脏病变会导致血清中胆汁酸含量的增加，因而胆汁酸含量测定成为肝脏功能检查的常用指标。
3、目前临床检测中通常使用3α-羟类固醇脱氢酶(3alpha-hydroxysterioddehydrogenase，3α-hsd，ec1.1.1.50)催化待检测样品中的胆汁酸c3羟基进行氧化反应，该反应同时将氧化型辅酶i或ii还原为还原性辅酶i或ii，通过测定340nm处的光吸收变化值计算得到待测样品中总胆汁酸的含量，该检测过程中，具有较高催化活性和稳定性的新酶挖掘和发现是研究的热点之一。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：包括，将氨基酸序列如seq idno.1所示的野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第201位精氨酸突变为甘氨酸得到氨基酸序列如seq id no.3所示的突变体3α-hsd-r201g；
5、或，将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第216位精氨酸突变为亮氨酸得到氨基酸序列如seq id no.4示的突变体3α-hsd-r216l；
6、其中，所述野生型3α-羟基类固醇脱氢酶来源于微生物c.testosteroniatcc11996，核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、作为本专利技术所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体一种优选方案，其中：所述突变体还包括，
8、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第201位精氨酸突变为甘氨酸的同时将其第216位精氨酸突变为亮氨酸，得到氨基酸序列如seq id no.5所示的突变体3α-hsd-r201g-r216l。
9、作为本专利技术所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体一种优选方案，其中：所述突变体还包括，
10、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第201位精氨酸突变为甘氨酸的同时将其第216位精氨酸突变为亮氨酸、第119位组氨酸突变为丙氨酸，得到氨基酸序列如seq id no.6所示的突变体3α-hsd-r201g-r216l-h119a。
11、作为本专利技术所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体一种优选方案，其中：所述突变体还包括，
12、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第82位缬氨酸突变为酪氨酸，或，
13、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第118位丙氨酸突变为苏氨酸，或，
14、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第77位赖氨酸突变为丙氨酸，或，
15、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第189位谷氨酸突变为酪氨酸，或，
16、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第75位谷氨酰胺突变为色氨酸，或，
17、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第200位脯氨酸突变为缬氨酸，或，
18、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第75位谷氨酰胺突变为色氨酸，或，
19、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第213位甲硫氨酸突变为丙氨酸，或，
20、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第119位组氨酸突变为丙氨酸，或，
21、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第74位脯氨酸突变为丙氨酸，或，
22、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第248位异亮氨酸突变为丝氨酸，或，
23、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第201位精氨酸突变为丙氨酸，或，
24、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第187位丙氨酸突变为丝氨酸，或，
25、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第216位精氨酸突变为丙氨酸，或，
26、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第191位脯氨酸突变为苏氨酸，或，
27、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第197位亮氨酸突变为甘氨酸，或，
28、将野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第195位丙氨酸突变为异亮氨酸。
29、本专利技术的再一目的是，提供一种编码具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。
30、本专利技术的再一目的是，提供一种包含所述编码基因的重组质粒。
31、本专利技术的再一目的是，提供一种包含所述重组质粒的宿主细胞。
32、本专利技术的再一目的是，提供一种表达所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的重组大肠杆菌。
33、本专利技术的再一目的是，提供一种具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因、包含所述编码基因的重组质粒、包含所述重组质粒的宿主细胞、表达所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的重组大肠杆菌在测量胆汁酸及生成12β-羟基-3-氧-5β-胆酸中的应用。
34、作为本专利技术所述应用的一种优选方案，其中：将所述具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体或含该突变体编码基因的表达系统添加至反应体系中，其中，所述反应体系以脱氧胆酸为底物，底物浓度为2～5mmol/l，还包括辅酶nad。
35、本专利技术有益效果：
36、本专利技术在来自微生物c.testosteroniatcc 11996的3α-羟类固醇脱氢酶基础上，通过半理性设计和定点突变技术改造3α-羟类固醇脱氢酶分子结构，最终获得了催化活性提高的3α-羟类固醇脱氢酶突变体，在30℃下孵育，3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶活最高达到34.18u mg-1，相较于野生型的4.61u mg-1，最高提升了785％。且本专利技术的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体应用于催化脱氧胆酸转的催化效率高，因此，本专利技术的3α-羟类固醇脱氢酶突变体在测量胆汁酸的应用中具有极高的应用价值。
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1.一种具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：包括，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第201位精氨酸突变为甘氨酸得到氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的突变体3α-HSD-R201G；
2.如权利要求1所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体还包括，
3.如权利要求1所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体还包括，
4.如权利要求1所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体还包括，
5.编码如权利要求1～4任一所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。
6.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求5所述的基因序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求6所述的重组质粒，包括细菌、真菌、植物细胞或动物细胞中的一种。
8.一种表达权利要求1～4任一所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体
9.如权利要求1～4任一所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体、权利要求5所述的基因、权利要求6所述的重组质粒、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8所述的重组大肠杆菌在测量胆汁酸及生成12β-羟基-3-氧-5β-胆酸中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：将所述具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体或含该突变体编码基因的表达系统添加至反应体系中，其中，所述反应体系以脱氧胆酸为底物，底物浓度为2～5mmol/L，还包括辅酶NAD+。
...【技术特征摘要】
1.一种具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：包括，将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型3α-羟基类固醇脱氢酶的第201位精氨酸突变为甘氨酸得到氨基酸序列如seq id no.3所示的突变体3α-hsd-r201g；
2.如权利要求1所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体还包括，
3.如权利要求1所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体还包括，
4.如权利要求1所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体还包括，
5.编码如权利要求1～4任一所述的具有高催化活性的3α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。
6.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求...
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