【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品检测，具体涉及一种用于检测大肠杆菌o157的特异性引物及检测方法。
技术介绍
1、大肠杆菌o157属肠出血型大肠杆菌，其能产生类志贺毒素，会造成人体出血性结肠炎，并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等疾病。大肠杆菌o157主要通过食用受污染的食物，如未煮熟的肉类、奶制品、水果和蔬菜等传播，在某些情况下可能会发生爆发性疫情。此外，也可能通过接触受感染的动物或人、饮用受污染的水等途径传播。现场快速检测是有效防止大肠杆菌o157食源性疾病爆发的措施，因此，一种快速检测食物中大肠杆菌o157的方法具有重要意义。
2、stx2基因是编码志贺毒素ⅱ型的毒力基因，通过检测stx2基因可以对大肠杆菌o157进行准确识别。stx2基因的检测方法包括基于pcr(聚合酶链式反应)、等温核酸扩增、微流控芯片等检测方法，但是这些检测方法均受限于检测设备和检测人员的高要求。环介导等温核酸扩增技术是最常见的等温检测方法，特异性强，灵敏度高，只需要恒温水浴设备就可以完成扩增过程。但其结果需要凝胶电泳呈现，不便于实现即时检测。而现有lamp技术对大肠杆菌o157的检测时间太长，而且操作较为复杂，同样不便于实现快速检测。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌o157的特异性引物及检测方法，以解决现有技术受限于检测设备和检测人员的高要求、无法快速实现检测的问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种用于检测大肠杆菌o157的特异性引物，所述特异性引物的序列如下：
4、上游外引物f3：5’-ctgctgtgacagtgacaa-3’；
5、下游外引物b3：5’-acaacggtttccatgacaa-3’；
6、上游内引物fip：
7、5’-tcatcatatatctggcgttaatggagttttctgctctggatgcatctc-3’；
8、下游内引物bip：
9、5’-aaccagtgagtgacgactgattttcggacagcagttatacca-3’；
10、下游环引物lb：5’-ttccggaacgttccagcg-3’。
11、优选地，上游内引物fip的5’端修饰地高辛，下游内引物bip的5’端修饰异硫氰酸荧光素。
12、优选地，所述特异性引物用于lamp检测大肠杆菌。
13、本申请还提供了一种大肠杆菌o157的快速检测方法，具体步骤如下：
14、步骤1：制作用于检测大肠杆菌o157的试纸条，所述试纸条上具有样品膜，还具有含抗fitc抗体的检测线和含山羊抗小鼠igg抗体的质控线；
15、步骤2：取待测样品，提取其基因组dna作为lamp扩增模板，采用权利要求1～2所述特异性引物对样品的基因组进行扩增，将扩增后的产物用pbs溶液稀释后滴加在所述试纸条上，通过检测线是否显色判断样品中是否还有大肠杆菌o157。
16、优选地，在步骤1中，所述试纸条的制作步骤如下：
17、s1：将50ml、质量百分数为0.01％的haucl4在磁力搅拌器上加热至沸腾，搅拌加入0.9ml的质量百分数为1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色变化，待溶液颜色稳定后继续加热15min，得到金纳米粒子溶液，避光保存于4℃备用；其中，金纳米粒子平均粒径为23nm；
18、s2：取s1得到的金纳米粒子溶液1ml，加入6μl、浓度为0.1mol/l的k2co3溶液中调节ph，再加入5.5μl、浓度为1mg/ml的地高辛抗体混合均匀，在室温下孵育60min，混匀后加入封闭液室温封闭30min后，在转速为9000r/min的条件下离心15min，弃上清液，沉淀用100μl、质量分数为10％的bsa进行重悬，得到10倍浓缩的金标抗体探针；
19、s3：取s2得到的金标抗体探针10μl，滴加至金标抗体结合垫上，27℃干燥2h；
20、s4：将浓度为2.2mg/ml的fitc抗体溶液均匀喷涂在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将浓度为1mg/ml的山羊抗小鼠igg抗体溶液均匀喷涂在硝酸纤维素膜上，得到质控线；
21、s5：将样品膜、金标抗体结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴组合至pvc底板上，得到所述试纸条。
22、优选地，在步骤2中，扩增产物与浓度为0.01mol/ml的pbs溶液按照体积比为2:50混合稀释。
23、优选地，在步骤2中，扩增体系为：
24、10×thermopol buffer反应缓冲液2.5μl；浓度为100mmol/l的mgso4水溶液1.5μl；浓度为10mmol/l的dntp 3μl；
25、其中，当外引物的浓度为0.2μmol/l时，外引物浓度与内引物浓度比为(1～8):1；且，上游外引物与下游外引物的浓度比为1:1，上游内引物与下游内引物的浓度比为1:1；浓度为10μmol/l的下游环引物lb 1μl；
26、扩增体系中，bst大片段酶的浓度为0.16～0.48u/μl；样品的dna模板1μl；
27、上述物质混合后，加水至25μl，在61～69℃条件下进行至少40min的扩增。
28、优选地，在步骤2中，增扩体系进一步优化为：
29、浓度为10μmol/l的上游内引物fip和下游内引物bip各2μl；浓度为10μmol/l的上游外引物f3和下游外引物b3各0.5μl。bst大片段酶浓度为0.32u/μl。扩增温度为63℃。
30、优选地，检测限为5.7×100cfu/ml，人工污染样品检测灵敏度为5.7×102cfu/ml。
31、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
32、1、本专利技术在对大肠杆菌o157的stx2基因设计特异性引物时，意外发现对上下游内引物5’端进行特殊修饰，能够赋予其可视化信号输出功能；同时，还能确保高的检测灵敏度，以及强的特异性，其对大肠杆菌o157的检测极限为5.7×100cfu/ml，人工污染样品检测灵敏性为5.7×102cfu/ml。
33、2、本专利技术所述检测方法以所述特异性引物为基础，将金标测流层析试纸卡与lamp技术相结合，不需要专用仪器，只需要插入、比对即可，具有快速、低成本，操作简单易行的优点，可实现目标致病菌的现场可视化检测，具有很广泛的应用前景。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于检测大肠杆菌O157的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述用于检测大肠杆菌O157的特异性引物，其特征在于，上游内引物FIP的5’端修饰地高辛，下游内引物BIP的5’端修饰异硫氰酸荧光素。
3.根据权利要求1所述用于检测大肠杆菌O157的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物用于LAMP检测大肠杆菌。
4.一种大肠杆菌O157的快速检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述大肠杆菌O157的快速检测方法，其特征在于，在步骤1中，所述试纸条的制作步骤如下：
6.根据权利要求4所述大肠杆菌O157的快速检测方法，其特征在于，在步骤2中，扩增产物与摩尔浓度为0.01mol/mL的PBS溶液按照体积比为2:50混合稀释。
7.根据权利要求4所述大肠杆菌O157的快速检测方法，其特征在于，在步骤2中，扩增体系为：
8.根据权利要求7所述大肠杆菌O157的快速检测方法，其特征在于，在步骤2中，增扩体系进一步优化为：
9.根据权利要
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测大肠杆菌o157的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述用于检测大肠杆菌o157的特异性引物，其特征在于，上游内引物fip的5’端修饰地高辛，下游内引物bip的5’端修饰异硫氰酸荧光素。
3.根据权利要求1所述用于检测大肠杆菌o157的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物用于lamp检测大肠杆菌。
4.一种大肠杆菌o157的快速检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述大肠杆菌o157的快速检测方法，其特征在于，在步骤1中，所述试纸条的制作步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙凤霞，崔双双，彭夏雨，常雨欣，郭梦澳，王子洋，张建，赵云峰，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：
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