本发明专利技术涉及成体干细胞与细胞治疗领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-199*（miR-199a/b-3p）的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，及其在肝癌细胞治疗中的应用。本发明专利技术公开了携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法。携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。利用本发明专利技术所述的携带miR-199*的AMSC制备肝癌细胞治疗制剂和化疗增敏剂，并应用于肝癌荷瘤小鼠模型的细胞治疗和化疗，可抑制异位肝癌的增殖，控制肝癌的转移；并可显著提高原位肝癌对化疗药物的敏感性，提高化疗效果，进而降低化疗剂量，减轻化疗副反应。本发明专利技术为制备新型的肝癌细胞治疗制剂和化疗靶向增敏剂提供了技术支持，并为肝癌的系统化疗提供了新方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及成体干细胞与细胞治疗领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-199*（miR-199a/b-3p）的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，及其在肝癌细胞治疗中的应用。本专利技术公开了携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法。携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。利用本专利技术所述的携带miR-199*的AMSC制备肝癌细胞治疗制剂和化疗增敏剂，并应用于肝癌荷瘤小鼠模型的细胞治疗和化疗，可抑制异位肝癌的增殖，控制肝癌的转移；并可显著提高原位肝癌对化疗药物的敏感性，提高化疗效果，进而降低化疗剂量，减轻化疗副反应。本专利技术为制备新型的肝癌细胞治疗制剂和化疗靶向增敏剂提供了技术支持，并为肝癌的系统化疗提供了新方法。【专利说明】
本专利技术涉及成体干细胞与细胞治疗领域，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-199* (miR-199a/b-3p)的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，及其在肝癌细胞治疗中的应用。
技术介绍
原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的死亡率一直高居不下，其对化疗和放疗的敏感性差，过去10年中仅发现有I种激酶抑制剂型化疗药物索拉非尼(sorafenib)对肝癌治疗有所帮助。因此探索肝癌的新型基因或分子标志物，并开发针对该靶点的治疗策略是肝癌治疗的重要问题。最近，miRNA与肝癌的关系日益受到关注。已有多项研究发现，在肿瘤组织中存在多种miRNAs的表达失调，这些miRNA可能通过对细胞恶性表型相关基因的表达调控而参与肿瘤的发生发展。而在肝癌组织中，miR-21、miR-26、miR-29、miR-122、miR-155、miR-221/222和miR_199a* (miR-199a/b_3p)等多种miRNAs分别以细胞凋亡逃逸、细胞周期调控、浸润和转移调控、炎症调控等方式影响肝癌进程。这其中，miR-199a*是最具价值的肝癌治疗靶点之一。研究发现，HCC的发生发展伴随miR-199a*的低表达，而外源导入miR-199a*则可抑制肝癌细胞增殖，并可增加其化疗敏感性、降低其侵袭性；另外还发现miR-199a*还可抑制HCV和HBV的复制，而HCV和HBV的持续感染与肝癌相关，因此miR-199a*有望作为肝癌防治的新靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供构`建携带miR_199a*的AMSC的方法，并应用于制备肝癌细胞治疗制剂中的应用，可以达到抑制肿瘤增殖，转移的效果，从而为临床应用携带miR-199*的AMSC进行肝癌靶向治疗提供依据。本专利技术公开了携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤:I)脂肪来源的间充质干细胞的制备:脂肪组织经DPBS清洗后，用I型胶原酶37°C消化I小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；2)携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞的制备:has_miR-199*表达质粒通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率(转染效率约70%)，以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4_6周后可获得稳定表达miR-199*的携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞。进一步的,所述脂肪组织为成人脂肪组织,所述miR-199*为hasniR-199*。携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的基本特性。携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞治疗制剂中的应用。(所述携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞为携带miR-199*的人脂肪来源的间充质干细胞)携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌细胞化疗增敏制剂中的应用。进一步的，所述的肝癌细胞为H印G2，Huh7和H印3B。进一步的， 所述制剂可控制肝癌细胞增殖和转移。进一步的，所述制剂可提高肝癌对化疗药物的敏感性。进一步的，所属制剂的剂型为注射剂。下面对本专利技术做进一步的说明。本专利技术公开了一种构建携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-199*)的方法，包括如下步骤:I)脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备:吸脂手术采集的成人脂肪组织经DPBS清洗后，用I型胶原酶37°C消化I小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。2)所述的携带miR-199*的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC_miR-199*)是按以下方法制备的:has_miR-199* 表达质粒(pGCMV/EGFP/has_miR-199*/Blasticidine)通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率，转染效率约70%。以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4_6周后可获得稳定表达 miR-199* 的 AMSC-miR-199*。3)所诉的 hsa-miR-199* 序列为:ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA。所述的携带has-miR-199*的AMSC采用荧光定量PCR鉴定miR-199*的表达:消化收集细胞后，采用Life technology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000232-l-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。PCR体系为:SYBR_10ul ；miR-199* 上游引物-2ul ;miR_199* 下游引物 _2ul ；R0X2-0.4ul ;水_1.6111 ;模板 _4ul ；PCR条件为:95°C预变性30s，然后95°C 5s,60°C 30s，40个循环。本专利技术公开了一种AMSC-miR-199*抑制肝癌细胞增殖的应用。所述的肝癌细胞为H印G2，Huh7和H印3B。所述的应用为，AMSC-miR-199*分别以 transwell 板(FALCON 公司，353090)与H印G2，Huh7和!fep3B共培养3天，胰酶消化收集细胞后进行肝癌细胞增殖和细胞凋亡的评估，以单独培养的H印G2，Huh7和!fep3B作为对照。本专利技术所述的携带miR-199*的成人脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-199*)在体外与H印G2，Huh7和!fep3B肝癌细胞共培养后，能抑制肝癌细胞增殖及活性。所述的肝癌细胞增殖及活性评估采用MTT法，步骤如下:1.胰酶消化收集共培养3天的肝癌细胞(!fepG2，Huh7和H印3B)，及单独培养的H印G2，Huh7和H印3B，按50本文档来自技高网...
【技术保护点】
携带miR?199*的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：1）脂肪来源的间充质干细胞的制备：脂肪组织经DPBS清洗后，用Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2?4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用；2）携带miR?199*的脂肪来源的间充质干细胞的制备：miR?199*表达质粒通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率，以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选，筛选4?6周后可获得稳定表达miR?199*的携带miR?199*的脂肪来源的间充质干细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：楼国华，刘艳宁，陈智，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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