具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有纤维素分解增强活性的多肽的变体。本发明专利技术亦涉及编码变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和使用所述变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸对于在联邦资助的研究和开发下完成的专利技术的权利的声明该专利技术是在由能源部授予的CooperativeAgreementDE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。政府在该专利技术中具有一定权利。对相关申请的交叉引用该申请要求2010年9月30日提交的美国临时申请系列号61/388,530的权益，其通过提述并入本文。涉及序列表本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。专利技术背景
本专利技术涉及具有纤维素分解增强活性的多肽变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。
技术介绍
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将含木素纤维素原料(lignocellulosicfeedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。WO2005/074647，WO2008/148131，WO2011/035027公开了来自土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2005/074656andWO2010/065830公开了来自橙橘嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2007/089290公开了来自里氏木霉(Trichodermareesei)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2009/085935，WO2009/085859，WO2009/085864，和WO2009/085868公开了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2010/138754公开了来自烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/005867公开了来自嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/039319公开了来自嗜热子囊菌属菌种(Thermoascussp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041397公开了来自青霉属菌种(Penicilliumsp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041504公开了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceous)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2008/151043公开了通过将可溶性活化二价金属阳离子添加至包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物来增加该多肽的活性的方法。在本领域中，改善具有纤维素分解增强活性的多肽增强木素纤维素原料的酶降解的能力会是有利的。本专利技术提供了具有改善的性质的具有纤维素分解增强活性的多肽。
技术实现思路
本专利技术涉及分离的β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQIDNO:2的成熟多肽的位置90，131，134，和141的一个或多个(例如几个)位置包含取代，其中所述变体具有纤维素分解增强活性。本专利技术亦涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。本专利技术亦涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在此种具有纤维素分解增强活性的变体的存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。本专利技术亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)在此种具有纤维素分解增强活性的变体的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。本专利技术亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在此种具有纤维素分解增强活性的变体的存在下用酶组合物糖化。附图说明图1显示通过连苯三酚和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶的组合；连苯三酚，烟曲霉GH61B野生型多肽，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶；以及连苯三酚，烟曲霉GH61B变体L90V+D131S+M134L+A141W，和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶所致的磷酸溶胀的纤维素(0.5%w/w)的转化。图2A和2B显示烟曲霉GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体L90V+D131S+M134L+A141W对里氏木霉纤维素酶组合物和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶的组合在50℃或55℃转化经预处理的的玉米秸秆(PCS)的作用。图3A(0.45mg/gGH61)和3B(0.75mg/gGH61)显示GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B变体L90V+D131S+M134L+A141W对高温纤维素酶组合物和烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶的组合在50℃，55℃，60℃或65℃PCS的作用。定义乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本专利技术而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEENTM20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolateanion)的酶量。等位变体(allelicvariant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.30 US 61/388,5301.一种具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的变体，其为SEQIDNO:2的成熟多肽的取代L90V+D131S+M134L+A141W。2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1的变体。3.一种核酸构建体，其包含权利要求2的多核苷酸。4.一种表达载体，其包含权利要求2的多核苷酸。5.一种宿主细胞，其包含权利要求2的多核苷酸，所述宿主细胞不属于植物品种。6.一种产生变体的方法，其包括：(a)在适于表达所述变体的条件下培养权利要求5的宿主细胞；和(b)回收所述变体。7.一种产生权利要求1的变体的方法，其包括：(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。8.一种用于获得具有纤维素分解增强活性的亲本多肽的变体的方法，其包括：在亲本多肽的对应于SEQIDNO:2的成熟多肽的位置90，131，134和141的位置处导入取代L90V+D131S+M134L+A141W，其中所述具有纤维素分解增强活性的亲本多肽选自下组：(a)多肽，其为SEQIDNO:2的成熟多肽；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸为SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列；和回收所述变体。9.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括在权利要求1的变体的存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。10.权利要求9的方法，其中所述纤维素材料经预处理。11.权利要求9或10的方法，其进一步包括回收经降解的纤维素材料。12.权利要求9-10任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。13.权利要求11的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。14.权利要求12或13的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。15.权利要求12或13的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。16.权利要求9-10、13任一项的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。17.权利要求14的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。18.权利要求15的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。19.权利要求16的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。20.权利要求17或18的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半...

【专利技术属性】
技术研发人员：M斯维尼，M沃古利斯，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，
类型：
国别省市：