高纯度肝素及其制备方法技术

本发明专利技术提供作为药品、化妆品、研究试剂等有用的高纯度肝素及其制备方法，更具体而言，涉及实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的肝素，以及如下所述的肝素的制备方法：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的乙醇，得到肝素的胶体状沉淀物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利申请要求日本专利申请第2010-205310号的优先权，在此将其全部内容引述至本说明书中作为参考。本专利技术涉及实质上不含引起副作用的物质、安全性高、作为药品、化妆品及研究试剂等有用的。
技术介绍
肝素是存在于肝、小肠、肺和皮肤等的、含有经硫酸化的D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、L-艾杜糖醛酸等的酸性粘多糖。肝素具有较强的抗凝血活性，除应用于弥散性血管内凝血(DIC)的治疗、各种血栓栓塞症(静脉血栓栓塞症、心肌梗塞、肺栓塞、脑栓塞、四肢动脉血栓栓塞、手术中、手术后的血栓栓塞等)的治疗及预防外，还可在使用血液透析、人工心肺机等体外循环装置时或插入血管导管时，或是在输血及血液检查等场合下用来防止血液凝固。此外，公知肝素除了具有抗凝血活性外，还具有脂蛋白脂肪酶活化作用、抗血小板凝集作用、降血压作用、抗补体作用、抑制癌症转移作用、抑制肥大细胞脱颗粒的作用、抑制局部炎症、镇痛以及促进肌肉组织的血液循环等多种生理活性。肝素主要是从健康的供食用动物的组织中提取/分级来制造的，但从BSE(牛海绵状脑病)问题出现后，作为药物的肝素的来源则基本为猪的小肠粘膜。通常，将猪小肠粘膜悬浮于水类溶剂中进行蛋白质消化，然后加入吸附剂等(非专利文献1)，以复合物的形式将肝素及其他粘多糖(主要是硫酸软骨素系列、硫酸乙酰肝素等)提取，将其作为粗原料。接着再对其进行批量混合/分级，得到肝素(所谓的“未分级肝素”)。用上述方法所得到的肝素(未分级肝素)含有除肝素外的粘多糖(主要是硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素B及硫酸软骨素C)，已经知道其含量会随粗原料及制造方法而不同。但是，确认了这种杂质的大致的副作用是可接受的，其结果，在很长一段时间里都将未分级的肝素用作药物。然而，2008年初在美国和德国报告发生了多起向患者静脉团注(快速静注)未分级的肝素制剂时，出现与以往不同的副作用的病例，最终演变成超过80人死亡的事件。美国FDA对这种未分级的肝素制剂及其原料药进行了分析，结果确认了其与一直以来所使用的产品存在明显差异，进一步地确认到了这种产品中存在过硫酸化硫酸软骨素(Oversulfated chondroitin sulfate:0SCS)(非专利文献2 4)。这种物质是自然界中不存在的物质，据说很可能是在制造原料药时混入的。日本国内虽然没有重度副作用的报告，但也回收了部分未分级的肝素制剂及低分子肝素(Low molecular weight heparin:LMWH)制剂，向市场稳定供应的问题变得严峻。许多研究人员根据OSCS的科学合成法、结构解析或动物实验等来探明有害现象的原因，特别是还根据IH-NMR和其他试验方法等对纯度及安全性的确认进行了研究(非专利文献5和6)，确认OSCS为造成日本国内有害现象的原因物质，确认/纯度实验的研究通过行政、制剂制造商来实施(非专利文献7和8)。另一方面，作为肝素的制造或者纯化方法，公知有I)非专利文献1、2)非专利文献9、3)非专利文献10和4)专利文献I等中记载的方法。但是，能够简便且有效地从肝素中除去0SCS、硫酸软骨素等杂质的方法，至今为止还是未知的。进一步地，简便地检出或测定上述肝素中杂质的方法至今为止是未知的。现有技术文献非专利文献非专利文献I:Roden, L.，Dorfman, A.，Acta Chem1.Scand.13,2121 (1959)非专利文献2:Nature Biotechnology, 2008, 26,669-675非专利文献3:The New England Journal of Medicine, 2008, 359, 2674-2684非专利文献4:The New England Journal of Medicine, 2008, 358, 2457-2467非专利文献5:Beyer, T.et al., Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,48,13-19(2008)非专利文献6:Guerrini, M.et al., Nature Biotechnology26,669-675 (2008)非专利文献7:橋井則貴6、医药研究39 (10) 651-659 (2008)非专利文献8: Jia , H., Nature Biotechnology26,477-478 (2008)非专利文献9:Schiller，S.et al.:J.Biol.Chem.236，983 (1961)非专利文献10:Schmidt, M and Dmochowski, A:Biochim.Biophys.Acta 83,137(1964)专利文献专利文献1:日本特开2002-29380
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题在于提供实质上不含0SCS、硫酸软骨素等杂质的、安全性高的高纯度肝素及其制造方法，以及在其制造过程中肝素纯度的确认方法。解决问题的方法本专利技术人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现:通过使用乙醇等有机溶剂在给定条件下对肝素进行分级，能够简便且有效地除去0SCS、硫酸软骨素等杂质，进一步地，由于这些杂质在给定条件下对亚硝酸分解具有抗性，因此，通过在进行该亚硝酸分解后采用HPLC进行分析，能够确认及测定它的存在及含量，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术中包含以下内容:肝素，其实质上不含抗亚硝酸分解的杂质。肝素，其通过下述方法得到，该方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(体积)的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到肝素的胶体状沉淀物。上述所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以5(T500mM的浓度溶解有盐。上述所述的肝素，其中，盐选自氯化钠及乙酸钠。上述 中任一项所述的肝素，其为胶体状。上述 中任一项所述的肝素，其分子量在300010000道尔顿范围内。肝素的制备方法，该方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(体积)的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到肝素的胶体状沉淀物。肝素，其通过下述方法得到，该方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(体积)的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到含有肝素的上清液。上述所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以5(T500mM的浓度溶解有盐。上述所述的肝素，其中，盐选自氯化钠及乙酸钠。上述 中任一项所述的肝素，其分子量在150(T12000道尔顿范围内。肝素的制备方法，该方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(体积)的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到含有肝素的上清液。药物，其含有上述及中任一项所述的肝素。根据上述及中任一项所述的肝素，其作为药物而使用。药物组合物，其含有上述及中任一项所述的肝素。粘多糖中 含有的抗亚硝酸分解的粘多糖或亚硝酸分解性粘多糖的检测或测定方法，该方法包括:将粘多糖进行亚硝酸分解。专利技术效果本专利技术的高纯度肝素由于不含引起副作用的物质OSCS等、因而安全性高，可优选用作药品、化妆品、研究试剂等使用。根据本专利技术的肝素的制备方法，能够简便地得到实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的高纯度肝素。此外，该方法有可能在工本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：六车三治男，村田浩志，
申请(专利权)人：国立大学法人宫崎大学，扶桑药品工业株式会社，
类型：
国别省市：