一种古菌嗜热酯酶及(S)-酮洛芬的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，它的步骤如下：（1）设计一对引物，以Thermotogamaritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化得到古菌嗜热酯酶。本发明专利技术采用基因工程方法在大肠杆菌Escherichiacoli中克隆表达该酯酶基因，制备了该酯酶蛋白，蛋白纯度高（95%以上）。该酯酶最适反应温度和反应pH分别为70℃和5.0-5.5；具有较好的耐酸性，在70℃和pH4.5反应体系中处理60min可以保持50%左右活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设计一种古菌嗜热酯酶及其用于制备(S)-酮洛芬的方法，属于生物工程

技术介绍
2-芳基丙酸类药物(2-APA)属于非留体消炎镇痛药(NSAIDS)，是解热镇痛、消炎抗风湿的基本药物和主要产品，它是目前处方药和非处方药处方量最大的一类药物。常用的有布洛芬、奈普生和酮洛芬3种，其α位有一个手性碳原子存在(S)-构型和(R)-构型一对光学对映体，临床上一般以外消旋体的形式供应。其中酮洛芬的消炎镇痛作用是阿司匹林的150倍，解热作用是阿司匹林的100倍，临床上用于治疗慢性类风湿性关节炎、变性性关节炎、外伤和术后疼痛等。药理实验表明，其(S)-异构体的消炎镇痛作用是外消旋酮洛芬的2倍，而(R)-异构体的活性很低，但有其他方面药用价值，它对牙周病的骨质疏松有治疗作用。目前，(S)-酮洛芬的制备方法主要有化学合成法和微生物酶法拆分。采用化学法合成(S)-酮洛芬，一般先得到等量的一对对映体混合物(外消旋体)，将其拆分是获得光学纯(S)-酮洛芬。通常利用手性试剂将外消旋体混合物中一对对映体转化为两种非对映体，然后利用非对映体理化性质的差异，将其分开，但此拆分过程较繁杂，手性试剂昂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，其特征在于：它的步骤如下：（1）设计一对引物:?上游[5’?GCC?CATATG?GTT?AAG?CTG?ATA?ATC?AAG?3’]，下游[5’?GAT?GTCGAC?TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC?3’]，以Thermotoga?maritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli?DH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E.?co...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏涛，张飞，冯昕，孙浩，姜春鹏，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：